人的胚胎干细胞(ES细胞)来源于囊胚的内细胞团，具有自我更新和向多个胚层细胞分化的能力，因此具有广泛的应用前景。目前培养人ES细胞的常用方法是以小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)作为饲养层，或在一种胞外基质如Matrigel上用MEF细胞的条件培养基进行培养。这种培养方式虽然能有效地维持人ES细胞的自我更新，但由于其中含有动物来源的成分，无法保证ES细胞不被动物病原体污染，从而在很大程度上限制了人ES细胞将来在临床上的应用。本课题的目的就是寻找在不依赖MEF饲养层或条件培养基条件下能够维持人ES细胞自我更新的外源因子。 MEF细胞的条件培养基能够支持人ES细胞在未分化的状态下进行增殖，表明MEF细胞能够分泌促进人ES细胞自我更新的关键因子。基于这一现象，作者尝试利用表达性克隆的技术来寻找由MEF细胞分泌的能维持人ES细胞自我更新的因子。作者首先构建了MEF细胞的cDNA文库，并将其划分为小的亚文库；之后将亚文库DNA转染入一种不能够维持人ES细胞未分化状态的靶细胞系中进行表达，并用转染的靶细胞制备条件培养基在Matrigel上培养人的ES细胞。ES细胞培养大约一周后通过形态观察和碱性磷酸酶活性分析筛选能够维持ES细胞不分化的培养组。目前，作者已经完成了620个亚文库的筛选工作，共发现了3个阳性亚文库。在下一阶段，作者一方面将对这3个亚文库进行更细致的拆分、筛选以便最终分离出其中发挥作用的cDNA克隆；另一方面还将对更多的亚文库进行筛选。 本课题还分析比较了一些候选基因在MEF细胞和同为小鼠胚胎成纤维细胞但却不能支持人ES细胞生长的NIH/3T3细胞系中的表达差异。候选基因包含bFGF、Wnt、TGFβ通路的重要配体分子以及BMP信号通路的主要胞外拮抗剂。根据比较的结果，BMP的拮抗剂Noggin在MEF细胞中显著表达而在NIH/3T3细胞中几乎不表达，而且还发现人ES细胞本身能够表达具有诱导分化作用的BMP信号分子，这意味着在正常的培养条件中应该存在BMP的拮抗剂来阻断BMP的诱导分化作用。因此，作者选择了对Noggin进行功能分析。首先，建立了稳定表达Noggin的NIH/3T3细胞系，发现该细胞的条件培养基能够抑制人ES细胞的分化；进一步，证明Noggin和bFGF共同作用，能够在Matrigel上不依赖MEF细胞的条件培养基而维持人ES细胞的未分化状态。用Noggin和bFGF联合培养的人ES细胞能够正常传代，保持了正常的形态、生长速度、核型以及向各胚层分化的多潜能，说明这两个因子对于人ES细胞自我更新的维持具有重要作用。 对维持人ES细胞自我更新外源因子的寻找和鉴定工作不但对最终发展出高效稳定的、完全没有动物来源成分的培养体系具有重要的借鉴意义，而且将有助于揭示调控人ES细胞自我更新过程的信号通路和分子机制。