背景：肿瘤血管生成(angiogenesis)在肿瘤生长和演进过程中至关重要。肿瘤血管生成不但为实体肿瘤生长所必需,还为肿瘤转移提高了便利条件。肿瘤血管生成还与肿瘤的预后密切相关,血管生成可以作为多种肿瘤复发、转移和预后的判断标准,例如浸润性乳腺癌、早期胃癌、肺腺癌等。　　 在乳腺癌基质中存在大量肿瘤相关巨噬细胞(Tumor associated macrophages,TAMs),其数量与疾病的预后呈负相关。CCL18是TAMs所分泌的标志性趋化因子之一。宋尔卫教授领导的课题组研究发现,从不典型增生一原位癌一浸润性导管癌,随着乳腺病理组织的异型性增大,乳腺组织CCL18的表达量升高,而增生的乳腺组织内不能检测到CCL18的表达。更重要的是,在浸润性导管癌病例中,CCL18表达量与病人的无病生存率及总生存率呈负相关;进一步发现乳腺癌细胞表面表达PITPNM3受体,与CCL18结合后,通过MAPK通路,改变细胞骨架及整合素的表达,从而促进乳腺癌细胞的侵袭性,同时诱导乳腺癌细胞发生上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT),证实了TAMs通过分泌CCL18,促进了乳腺癌细胞的侵袭和转移能力。因此,以CCL18作为靶向TAMs治疗乳腺癌的分子靶点,干预TAMs分泌CCL18可能是未来治疗乳腺癌的新思路。但是,CCL18与肿瘤血管生成的相关性目前未见报道,TAMs是否通过分泌CCL18影响乳腺癌血管生成,从而影响乳腺癌的侵袭转移尚不清楚。本课题旨在探索TAMs通过分泌CCL18对乳腺癌血管生成的影响及其机制。　　 目标：　　 1.通过临床病例分析,探讨乳腺癌组织中表达CCL18的TAMs浸润对乳腺癌血管生成的影响及与病情、预后的关系。　　 2.建立巨噬细胞、乳腺癌细胞与内皮细胞的共培养模型,模拟乳腺癌组织微环境,观察TAMs通过分泌CCL18对血管生成及血管内皮细胞迁移、增殖的影响。　　 3.观察CCL18对内皮细胞间质转化(EndoMT)的影响。　　 4.探讨CCL18影响内皮细胞迁移的信号通路。　　 5.在动物模型中验证CCL18对乳腺癌血管生成的影响。　　 方法：围绕上述研究目标,本研究所采取的主要研究方法:　　 1.采用免疫组织化学双染方法,分析乳腺癌组织切片中表达CCL18的TAMs浸润与微血管密度(microvessel density,MVD)数量变化情况,结合临床资料,探讨乳腺癌微环境中表达CCL18的TAMs浸润对血管生成的影响及与病情、预后的关系。　　 2.分离原代TAMs和人脐静脉内皮细胞(HUVECs),建立巨噬细胞、乳腺癌细胞与内皮细胞的共培养模型,通过体外血管生成实验及鸡胚绒毛尿囊膜血管生成模型(CAM法)观察CCL18对血管生成的影响;通过Transwell迁移试验、中和性抗体及RNA干扰技术观察CCL18对血管内皮细胞迁移功能的影响;通过MTT法、细胞周期检测、Brdu掺入试验观察CCL18对血管内皮细胞增殖的影响。　　 3.通过免疫荧光及western blotting观察CCL18对内皮细胞EndoMT的作用。　　 4.通过流式细胞技术、western blotting及RNA干扰技术初步探讨HIJVECs表面是否表达PITPNM3受体,然后运用RNA干扰技术沉默PITPNM3,观察其对HVECs细胞迁移及血管生成的影响,寻找OCL18影响内皮细胞迁移的信号通路。　　 5.将乳腺癌MDA-MB-231细胞种植于免疫缺陷的NOD/SCID小鼠的乳腺脂肪垫下,成瘤后在瘤内定期注射CCL18,观察CCL18对肿瘤MVD及肿瘤生长、转移的影响,通过动物模型中验证CCL18促进乳腺癌血管生成。　　 结果：病例分析结果显示,在乳腺浸润性导管癌病例中,表达CCL18的TAMs浸润与乳腺癌MVD呈正相关,与肿瘤大小、分期、分化程度、淋巴结转移程度和远处转移程度相关。体外血管生成试验和CAM血管生成试验均显示CCL18促进了血管生成。　　 我们在巨噬细胞、乳腺癌细胞与内皮细胞的共培养模型中,研究TAMs和激活的巨噬细胞通过分泌CCL18对血管内皮细胞迁移能力的影响,结果显示CCL18可以促进内皮细胞的迁移能力,用CCL18的中和性抗体及靶向CCL18的siRNA可以抑制TAMs和选择性激活的巨噬细胞对内皮细胞的促迁移作用,证实TAMs和选择性激活的巨噬细胞可以通过分泌CCL18促进内皮细胞的迁移。MTT增殖分析、Brdu掺入试验、细胞周期分析等一系列实验结果显示CCL18不促进内皮细胞的增殖。　　 我们以经典诱导EMT的TGF-β为对照,通过免疫荧光及western blotting观察到经CCL18处理后的HUVECs发生EMT标志性蛋白分子E-cadherin表达下调,VE-cadherin、vimentin、fibronectin表达上调,提示TAMs可能通过分泌CCL18促进内皮细胞EndoMT转化。　　 流式细胞学及western blot结果显示在HUVECs细胞上存在PITPNM3表达,而靶向PITPNM3的siRNA可以部分沉默PITPNM3的表达,并减弱CCL18对HLNECs细胞的促迁移和促血管生成作用。在HUVECs细胞中,CCL18可以激活ERK、AKT,导致磷酸化的GSK-3beta-Ser9增多,继而Snail增多,促进细胞的迁移。在动物模型中我们发现,与对照组相比,瘤内注射CCL18的荷植瘤MVD增高,较易发生肝肺远处转移。　　 结论：　　 1.乳腺癌微环境中表达CCL18的TAMs浸润程度与MVD相关,与乳腺癌患者的病情进展呈负相关。　　 2.TAMs通过分泌CCL18促进内皮细胞迁移,从而促进乳腺癌血管生成。　　 3.HUVECs细胞表达PITPNM3,CCL18可能通过与PITPNM3结合,激活ERK、AKT信号通路,促进细胞迁移。　　 4.动物模型证实CCL18可促进乳腺癌血管生成及肿瘤远处转移。