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目的:1.通过建立对氧磷(PO)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)氧化应激损伤模型,初步探讨Notch1信号通路在PO引起氧化应激损伤中的作用。2.探讨植物雌激素染料木素(Gen)对PO引起的HUVECs氧化应激损伤的保护作用与Notch1信号通路之间的关系。方法:1.PO氧化应激损伤模型建立:以不同浓度(0,300,600,900,1200,2400μM)的PO和溶媒0.1%DMSO处理HUVECs 24 h,用试剂盒分别测定各组细胞活力(OD值)、乳酸脱氢酶(LDH)释放量、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的含量;Western blot法检测各组细胞中Notch1、Hes1、Bax、Caspase3和Bcl-2蛋白表达水平。观察PO对HUVECs的氧化损伤效应的量效关系。选择上述实验中获得的最佳PO刺激终浓度(1200μM)处理HUVECs不同时间(0,6,12,24 h),同上检测各生化指标和蛋白表达。观察PO对HUVECs的氧化应激损伤的时效关系。2.Gen保护HUVECs氧化应激损伤的量效、时效关系观察:以不同浓度的Gen(0,0.05,0.1,0.5,1μM)与HUVECs共同孵育10 h,再以PO(1200μM)处理huvecs24h。检测各项生化指标和蛋白表达,观察gen保护huvecs免受氧化应激损伤的量效关系。再以最佳浓度gen(0.5μm)预处理huvecs不同时间(0,6,10,14h)后,观察gen保护huvecs受氧化应激损伤的时效关系。3.gen抗po氧化应激损伤作用与notch1信号通路的关系初探:培养的huvecs分为空白对照、po刺激、po+dapt、dapt处理、gen+po+dapt和po+gen六组。以gen(0.5μm)预处理huvecs10h后,加notch1特异性阻断剂dapt(10μm)和/或po(1200μm)再共同培养24h后分别测定细胞活力、ldh、sod和mda含量,再次检测各蛋白的表达水平。结果:1.不同浓度po处理huvecs24h后,在显微镜下观察300、600μm的po刺激huvecs24h后,细胞形态等均无明显改变,1200、2400μm的po刺激可引起细胞内空泡与碎片增多,细胞间排列稀疏;空白组与dmso组细胞状态良好。cck8分析结果显示与空白对照组相比,不同浓度的po(900,1200,2400μm)作用于huvecs可剂量依赖性地导致细胞活力降低(p<0.01)。溶媒对照(0.1%dmso)与空白组相比细胞活力下降不明显(p>0.05)。培养液中相关生化指标测定结果显示,与空白对照组相比,po(600、900、1200、2400μm)刺激可导致细胞培养液ldh和mda含量显著升高,sod含量显著降低(p<0.01)。western-blot结果显示,与空白对照组相比,1200μm的po可显著上调notch1、hes1、bax、caspase3的表达(p<0.05),同时下调bcl-2的表达和降低bcl-2/bax比值(p<0.05)。2.采用1200μmpo刺激huvecs不同时间(0,6,12,24h),可呈时间依赖性地降低细胞活力(p<0.05),升高ldh和mda含量,sod含量显著降低(p<0.05)。po刺激24h可显著上调notch1、hes1、bax、caspase3的表达(p<0.05),下调bcl-2的表达,降低bcl-2/bax比值(p<0.05)。3.用gen(0.5,1μm)预处理的细胞存活率显著升高,培养液中ldh和mda含量显著降低,sod活性显著升高,且在0.5μm浓度处理条件下效果最明显(p<0.05)。与po组相比,gen(0.5μm)可显著下调notch1、hes1、bax、caspase3的表达(p<0.05),上调bcl-2表达和增加bcl-2/bax比值(p<0.05)。4.用gen(0.5μm)预处理huvecs不同时间,随着保护时间的延长细胞活力显著上升(p<0.01),培养液中ldh和mda含量显著下降,sod含量显著升高(p<0.05)。gen预处理10,14h后可显著下调notch1、hes1、caspase3、bax的表达(p<0.05),上调bcl-2的表达,增加bcl-2/bax比值(p<0.05),具有时间依赖性。5.用notch1通路的特异性阻断剂dapt(10μm)处理细胞后,与po+gen组相比,显微镜下可见p+d+g组细胞受损明显,细胞脱落较多,细胞间隔增大。cck8分析结果表明,与空白组相比,dapt组细胞活力无明显变化(p>0.05)。加了po的各组细胞活力显著下降(p<0.05)。与po+gen组相比,po+dapt+gen组细胞活力同样下降(p<0.05)。酶学测定显示,与空白对照组相比,加了po的各组细胞培养液中ldh和mda含量显著上升,sod含量显著下降(p<0.05)。与gen+po组相比,Gen+PO+DAPT组细胞LDH和MDA含量显著上升,SOD含量显著下降(P<0.05)。Western-blot结果显示,与空白组相比,PO(1200μM)刺激24 h可显著上调Notch1、Hes1、Caspase3、Bax的表达(P<0.05),下调Bcl-2的表达,降低Bcl-2/Bax比值(P<0.05),而DAPT组上述蛋白表达变化没有统计学意义。与Gen+PO组相比,PO+DAPT+Gen组可显著上调Notch1、Hes1、Bax、Caspase3的表达(P<0.05),下调Bcl-2表达,降低Bcl-2/Bax比值(P<0.05),提示Gen拮抗HUVECs氧化应激损伤很可能是通过调控Notch1信号通路来实现。结论:1.PO呈浓度与时间依赖性地损伤HUVECs,Gen对PO刺激导致的HUVECs氧化应激损伤具有保护作用。2.对氧磷可上调Notch1、Hes1、Caspase3、Bax蛋白,下调Bcl-2蛋白表达,降低Bcl-2/Bax比值损伤血管内皮细胞,Gen通过调节上述蛋白表达保护HUVECs免受PO刺激引起的氧化应激损伤。