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2,3-丁二醇（2,3-butanetriol,简称2,3-BD）及其衍生物是一种重要的生物基化学品,它在化工、食品、医药、燃料和航空等多个领域有广泛应用。由于化学法诸多缺点,因此,生物法生产2,3-丁二醇成为了国内外的研究热点。肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）作为2,3-丁二醇的产生菌,具有适应环境能力强、底物范围广、代谢彻底、副产物较少、产物浓度和转化率较高等优点,是有工业化生产前景的菌株之一。本研究以实验室保藏的三株肺炎克雷伯氏菌（K.pneumoniae）HD79/HD79-01（Δldh）/HD79-02（Δldh、Δack）作为出发菌株,首先运用转录组学结合q RT-PCR技术从基因水平上分析K.pneumoniae HD79和HD79-02（Δldh、Δack）的差异;再次对K.pneumoniae HD79-01（Δldh）/HD79-02（Δldh、Δack）外源添加乙酸,运用酶学技术和q RT-PCR探讨酸醇之间产生的机理;最后敲除K.pneumoniae HD79/HD79-01（Δldh）/HD79-02（Δldh、Δack）这三株菌支路代谢乙醛脱氢酶基因（Aldehyde dehydrogenase,ald A）获得肺炎克雷伯氏菌工程菌株并进一步提高2,3-BD产量,为实现工业化生产2,3-丁二醇的菌种提供了保障。本研究第一阶段以K.pneumoniae HD79和HD79-02（Δldh、Δack）为出发菌株利用转录组学结合q RT-PCR技术从基因水平上分析这两株菌的差异表达基因。共得到基因9654条,4628差异表达基因其中404个显著上调表达基因和162个显著差异下调表达基因,这些差异基因根据GO分类结果分为三个主要类别:生物过程,细胞组分和分子功能。其中生物过程中与生物调节、代谢调节、细胞核转运过程相关;细胞组成、细胞膜组成、细胞核组成均为细胞组分相关的功能;而分子功能则大多数与核酸转录激活因子以及细胞核转运活性相关。在上调表达基因中,调节Lys R family转运功能的bud R基因部分上调表达,bud R与产2,3-BD相关的三个关键酶基因Bud A,Bud B和Bud C息息相关并且在乙酸,低p H,厌氧条件下可以诱导2,3-丁二醇形成。q RT-PCR显示bud R上调基因的表达量改变倍数与显著差异基因测序数据结果中差异基因表达倍数基本保持一致,这也证明了差异表达基因测序获得信息具有较高的准确性。本研究第二阶段利用本课题组前期已构建的ldh缺失重组菌株K.pneumoniae HD79-01和ldh和ack缺失重组菌株K.pneumoniae HD79-02作为出发菌株,根据乳酸和乙酸的降低的产量（4.94 g/L和4.28 g/L下降到2.45 g/L和1.59 g/L）对这两株突变株添加不同浓度的乙酸分别为0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 g/L和0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 g/L,根据2,3-丁二醇的产量和菌株的生长情况从而确定乙酸的最适浓度分别为2.3 g/L和2.5 g/L,采用q RT-PCR、酶活力测定、2,3-丁二醇产量以及代谢组学技术等指标验证乙酸对重组菌株产2,3-丁二醇的影响。结果表明K.pneumoniae HD79-01外源添加2.3 g/L的乙酸2,3-BD转化率和生产强度比K.pneumoniae HD79-01和K.pneumoniae HD79分别提高了81.3%、115%和80%、115%;在整个发酵过程中共检测出80风味成分,分别为醇类、烷类、苯及衍生物类和酸类等主要物质,其中相对含量最多的为醇类,其中2,3-丁二醇又是检测到醇类中含量最高的物质,它的相对百分含量在发酵过程中呈上升趋势,且试验组（K.pneumoniae HD79-01添加2.3 g/L乙酸）高于对照组（K.pneumoniae HD79与K.pneumoniae HD79-01）在72 h相对含量最大,为8.54%;而K.pneumoniae HD79与K.pneumoniae HD79-01分别在48和72 h达到最大分别为4.98%和6.12%。K.pneumoniae HD79-02外源添加2.5 g/L的乙酸2,3-BD转化率和生产强度比K.pneumoniae HD79-02和K.pneumoniae HD79分别提高了50%、238%和48%、237%;同样GC-MS显示2,3-丁醇含量在发酵过程中呈上升趋势,且试验组高（K.pneumoniae HD79-02添加2.5 g/L乙酸）于对照组（K.pneumoniae HD79与K.pneumoniae HD79-02）在72 h相对含量最大,为10.79%;而K.pneumoniae HD79与K.pneumoniae HD79-02分别在48和72 h达到最大分别为4.9%和5.6%。本研究第三阶段利用K.pneumoniae HD79和本课题组前期已构建的ldh缺失重组菌株K.pneumoniae HD79-01和ldh和ack缺失重组菌株K.pneumoniae HD79-02作为出发菌株,利用PCR技术,以K.pneumoniae HD79/HD79-01/HD79-02基因组为模板,克隆ald A基因片段1440 bp;以质粒p EGFP-C3为模板,扩增出一段长995 bp荧光标记基因（EGFP）序列。采用酶切连接的方式进行体外拼接,将EGFP基因插入于ald A基因片段内部,构建重组序列ald A1-EGFP-ald A2;筛选敲除成功的重组菌株K.pneumoniae HD79-03/04/05,同样采用PCR、q RT-PCR、ald A酶活力测定以及2,3-丁二醇产量等指标验证重组菌株。结果表明在72h,重组菌株K.pneumoniae HD79-03的乙醛脱氢酶酶活力（0.271±0.02 U/g）低于原始菌株K.pneumoniae HD79（0.404±0.02 U/g）,同比下降了33.2%;重组菌株2,3-丁二醇的产量59.2 g/L,生产强度为0.49 g/L·h,转化率为0.44 g/g,原始菌株的2,3-丁二醇的产量32.7 g/L,生产强度为0.27 g/L·h,转化率为0.26 g/g,分别提高了82.8%、81.4%和69.2%,差异显著（p＜0.05）。在24h,重组菌株K.pneumoniae HD79-04的乙醛脱氢酶酶活力（0.126±0.02 U/g）低于原始菌株K.pneumoniae HD79（0.214±0.02 U/g）,同比下降了41.1%;重组菌株2,3-丁二醇的产量58.7 g/L,生产强度为0.55 g/L·h,转化率为0.49 g/g,原始菌株的2,3-丁二醇的产量32.7 g/L,生产强度为0.26 g/L·h,转化率为0.25 g/g,分别提高了86.2%、111%和96%,差异显著（p＜0.05）。在72h,重组菌株K.pneumoniae HD79-05的乙醛脱氢酶酶活力（0.254±0.02 U/g）低于原始菌株K.pneumoniae HD79（0.404±0.02 U/g）,同比下降了37.1%;重组菌株2,3-丁二醇的产量65.9,生产强度为0.61 g/L·h,转化率为0.51 g/g,原始菌株的2,3-丁二醇的产量,32.7,生产强度为0.27 g/L·h,转化率为0.26 g/g,分别提高,101%、125%和96.1%,差异显著（p＜0.05）。本研究从转录组学上分析了K.pneumoniae HD79和K.pneumoniae HD79-02基因的差异表达水平;深入研究了乙酸和2,3-丁二醇之间产生的理论;成功构建了ald A基因缺失突变株,为工业生产2,3-丁二醇提供理论基础和技术保障。