CIK细胞源微囊泡对K562细胞的影响及AML患者血清微囊泡源miRNA表达谱的初步研究

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背景:白血病是一类起源于造血干细胞/造血祖细胞的高度异质性恶性血液肿瘤。当前,以化疗为主的综合治疗使患者的缓解率得到明显提高,但患者的长期生存率仅约为20%;另外,只有少数类型的白血病具有特异性的诊治标记物;鉴于此,探索白血病的治疗策略以及寻找特异性的诊治标记物和治疗靶点,对改善治疗效果、提高患者生存率具有重要意义。微囊泡是活细胞释放于胞外的纳米级囊泡,依其体积大小不同可分为微粒、外泌体及凋亡小体。微囊泡携带亲本细胞源的核酸(如DNA,mRNA,miRNA等)、蛋白质以及脂质等生物信息分子,可随体液流动远距离调控靶细胞的生理、病理活动,是细胞间对话的信息载体,是探索疾病发病机制、挖掘诊治标记物的切入点。CIK细胞是以CD3~+CD56~+细胞为主的异质细胞群,在清除白血病微小残留病灶中具有较好的疗效,但对于CIK细胞源微囊泡是发挥协同溶瘤作用还是拮抗作用尚不清楚。目的:本研究拟观察CIK细胞源微囊泡对髓系白血病K562细胞的增殖、凋亡及迁移能力的影响,以及检测AML患者血清微囊泡源miRNA表达谱,筛选表达差异显著的miRNA标志物,为明确CIK细胞源微囊泡的生物学特性,探讨AML患者血清来源微囊泡特异性miRNA分子的功能提供重要线索。方法:首先,联合多种刺激因子诱导培养髓系白血病患者外周血单个核细胞为CIK细胞,用流式检测CD3~+CD56~+细胞表型,CCK-8检测CIK细胞对K562细胞的杀伤效应。梯度离心法与ExoQuick离心柱法提取CIK细胞培养上清来源的微粒及外泌体。用扫描电镜观察微囊泡的超微结构,用qPCR、蛋白质印记检测微囊泡的标记物;其次,用CCK-8法检测CIK细胞源微囊泡对K562细胞活力的影响,流式分析细胞凋亡以及Transwell系统观察微囊泡对K562细胞迁移能力的影响。另外,分别收集3例急性髓系白血病患者和3例健康志愿者血清,用ExoQuick试剂盒获取血清源外泌体,通过Illumina HiSeq X10平台测序获取血清外泌体miRNA表达谱,筛选差异表达的miRNA筛选差异表达miRNA,并对其进行靶基因预测以及功能注释。结果:(1)在体外联合rhIFN-γ、rhIL-2和Anti-CD3单抗诱导髓系白血病患者外周血单个核细胞活化为CIK细胞,细胞增殖能力强,培养14 d后CD3~+CD56~+在CIK细胞中占比(21.50±6.20)%,5:1,10:1及20:1效靶比下对K562细胞株杀伤率分别为:31.31±5.20%,56.63±8.88%与81.87±5.86%。(2)扫描电镜观察到CIK细胞源微囊泡呈圆形,直径约为30-1000 nm;CIK细胞源微囊泡携带HSP-70、穿孔素、颗粒酶、CD2与TCR-αmRNA;表达微囊泡标记蛋白CD9,HSP-70以及亲本细胞CIK特异性蛋白GZM-B,CD2与TCR-α。(3)CIK细胞培养上清对K562细胞增殖没有明显影响(p>0.01),K562在CIK细胞源微囊泡孵育后迁移能力显著增加(p<0.01)。20ug/m L与50ug/m LCIK细胞源微囊泡孵育K562细胞48小时后,细胞凋亡率降低(p<0.01),qPCR和Western-Blot检测到50ug/m L微囊泡孵育K562细胞48小时后,IDO-1、MMP-9表达增加,而VEGF的表达降低。(4)在送检的6份血清样本中检测微囊泡携载3,194个miRNA,其中已知miRNA 1,742个,新预测mi RNA 1,452个。在急性髓系高白细胞白血病组中,筛选到表达水平有统计学差异的15个miRNA表达上调,11个miRNA表达下调;在急性髓系非高白细胞白血病中,表达上调的miRNA有11个,表达下调的miRNA有8个;对其进行生物信息学分析的结果提示差异表达的miRNA参与调控肿瘤相关的信号通路,尤其是在MAPK、Wnt、NF-κB和hippo信号通路中出现富集。结论:CIK细胞源微囊泡促进K562细胞迁移,诱导IDO-1、MMP-9表达上调,而下调VEGF的表达。在急性髓系高白细胞白血病患者血清外泌体中,筛选到表达水平有统计学差异的15个miRNA表达上调,11个miRNA表达下调;在急性髓系非高白细胞白血病中,表达上调的miRNA有11个,表达下调的miRNA有8个。上述研究结果提高了对CIK细胞源微囊泡的认识以及为挖掘髓系白血病的诊治标记物提供了重要线索。
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