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目前,蛋白质体外重折叠复性技术已成为基因工程蛋白质产业化的瓶颈问题之一。蛋白质体外重折叠过程中聚集体的形成是制约蛋白质恢复正确空间结构的一个主要原因,向复性体系中加入能够协助目标蛋白复性的试剂,即折叠助剂,是解决这一问题的有效方法,因而开发新型、高效,同时又易于操作和回收利用的蛋白质体外复性添加剂成为近年来的研究热点。N-异丙基丙烯酰胺(NIPA)类聚合物是应用广泛的一种温敏型聚合物,是一种蛋白质体外复性的候选添加剂。本文以NIPA类聚合物的合成、性能表征及其在协助蛋白质体外复性中的应用为主线,开展了四个方面的工作:其一,交联网状聚合物PNIPA、NIPA与丙烯酸钠(SA)的网状共聚物P(NIPA-co-SA)的合成、性能表征及其协助目标蛋白溶菌酶(lysozyme)体外复性效果的考察;其二,线性聚合物PNIPAAm的合成、性能表征及其协助溶菌酶体外复性效果的考察;其三,兼具交联网状聚合物和线性聚合物优点的接枝型聚合物—含温敏性PNIPAAm毛发的聚苯乙烯微球(PS-grafted-PNIPAAm)的制备、性能表征及其协助溶菌酶体外复性效果的考察;其四,三种不同类型聚合物温敏性能及其协助蛋白质体外复性效果的比较,并对其协助复性的机理进行了探讨。交联网状聚合物的合成、性能表征及其协助溶菌酶体外复性效果的考察:采用反相悬浮聚合法合成了粒状PNIPA凝胶及其与丙烯酸钠(SA)的共聚凝胶P(NIPA-co-SA),温敏性能研究表明,两种凝胶具有相似的温度敏感性,但其低临界溶解温度(LCST)有所不同,分别为33℃和39℃;凝胶粒子的直径在200～500μm之间,表面分布着不规则微孔。在温度为30℃,尿素浓度为3mol/L,GSH和GSSG的浓度分别为3mmol/L和0.375mmol/L(GSH:GSSG=8:1)的复性条件下,当目标蛋白溶茵酶的终浓度为250μg/ml时,加入2mg/ml PNIPA粒状凝胶可使溶菌酶的活力回收率达到72.9%,明显高于稀释复性的51.3%;加入3mg/ml粒状P(NIPA-co-SA)共聚凝胶可使溶菌酶的活力回收率提高到71.5%。不同稀释倍数下两种凝胶协助复性实验表明,溶菌酶初始浓度越高,与稀释复性相比凝胶协助复性的效果就越好,在蛋白质体外重折叠过程中具有一定的优势。两种凝胶重复利用6次后溶菌酶的活力回收率仍分别高出稀释复性15%和12%以上。两种凝胶协助复性和稀释复性的时间基本相同,凝胶的加入并没有成为复性的限速步骤。线性聚合物的合成、性能表征及其协助溶菌酶体外复性效果的考察:采用自由基聚合法,以偶氮二异丁腈(AIBN)为引发剂,N-异丙基丙烯酰胺(NIPA)为单体,在乙醇溶液中合成了PNIPAAm。温敏性能研究表明,其低临界溶解温度(LCST)约为32℃,该值受PNIPAAm基团的亲水疏水相互作用强弱变化的控制,随PNIPAAm分子量、溶液浓度和溶液组成不同而略有变化。PNIPAAm凝胶具有较好协助溶菌酶复性的效果,与稀释复性相比,PNIPAAm可大大提高蛋白复性的初始浓度,在协助蛋白质复性上有较大优势。当溶菌酶浓度为600μg/ml时,活性回收率从稀释复性的11.93%提高到79.83%,改进非常明显。系统考察了复性液中PNIPAAm与溶菌酶浓度比(w/w)、尿素浓度和复性温度对溶菌酶复性效果的影响,确定本实验中合适的复性条件为,PNIPAAm与溶菌酶浓度比8、尿素浓度1.8mol/L、复性温度30℃。接枝型聚合物PS-grafted-PNIPAAm微球的制备、性能表征及其协助溶菌酶体外复性效果的考察:采用无皂乳液聚合法和紫外光引发表面接枝技术制备了PS-grafted-PNIPAAm微球,获得了Particle A(PS核心直径442nm,PNIPAAm高分子毛发层厚度122nm)和Particle B(PS核心直径442nm,PNIPAAm高分子毛发层厚度89nm)两种微球。微球形貌为圆球形,且粒径分布较为均一,单分散性良好,尺寸为亚微米级,其LCST均在34℃左右。将PS-grafted-PNIPAAm微球应用于溶菌酶的体外复性中,优化的复性工艺条件为:复性温度30℃,复性液中尿素浓度3mol/L,GSH与GSSG的浓度比8:1(其中GSSG的浓度0.375mmol/L),Particle A和Particle B与溶菌酶的浓度比分别为0.5和1.0。在优化的复性条件下,Particle A和Particle B的加入可以在较高蛋白浓度条件下显著地提高其活性收率,当溶菌酶的浓度为500μg/ml时,Particle A和Particle B的加入使得复性后的活性回收率分别达到了71.5%和58.0%,比稀释复性的收率提高了36.7和23.2个百分点,从而极大地降低了复性过程的成本。Particle A和ParticleB的加入,在提高溶菌酶活性收率的同时,使复性过程达到平衡所需的时间略有延长,从稀释复性时约4 h延长至4.5 h。三种聚合物温敏性能、协助蛋白质体外复性效果的比较,及其协助复性的机理初探:在上述实验的基础上,将制得的三种聚合物进行性能及协助复性效果的比较。三种聚合物都具有显著的温度敏感性,但低临界溶解温度(LCST)有所不同。在协助蛋白质体外复性的过程中,线性聚合物的效果最佳,但复性完成后不易与目标蛋白分离,难以重复利用;交联网状聚合物易于从复性体系中分离出来,但协助复性效果相对较差,且由于凝胶网络的吸附会造成蛋白损失;接枝型聚合物则兼具高效和易分离的特点,其应用前景值得期待。采用动力学模型拟合和荧光光谱分析的方法对N-异丙基丙烯酰胺类聚合物协助复性的机理进行了初步研究,结果表明,在复性过程中起主要作用的是其上的疏水基团—异丙基与溶菌酶疏水区域之间的疏水相互作用,这种作用阻止了蛋白折叠过程中的聚集沉淀,使复性向天然态的构象进行。总之,全文围绕N-异丙基丙烯酰胺类聚合物的制备、性能表征和在蛋白质复性中的应用开展了系列研究,成功完成了制备-性能表征-应用-机理的研究路线,为进一步开发新型、高效、易于分离回收的蛋白复性添加剂奠定了基础。