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头颈鳞状细胞癌（Head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC,简称头颈鳞癌）主要起源于口腔,咽和喉的黏膜上皮。抽烟,饮酒以及人乳头瘤病毒（Human papilloma virus,HPV）感染是头颈鳞癌的主要致病因素。2020年全球癌症统计数据显示,全世界每年新发的头颈鳞癌病例接近90万,死亡病例约45万,给世界各国造成了巨大负担。目前头颈鳞癌主要的治疗方式包括手术治疗,放射治疗和化学药物治疗。尽管多种治疗方式都在不断改进与提高,然而对于多数晚期或复发性头颈鳞癌患者是无效的。对头颈鳞癌发生发展的生物学机制进行深入探究,可以为开发新型有效的治疗方式提供理论基础。肿瘤细胞免疫逃逸是肿瘤的主要特征之一。头颈鳞癌能够利用多种机制,通过分泌大量免疫抑制性细胞因子,募集免疫抑制性细胞进入肿瘤微环境,表达免疫检查点配体等方式抑制免疫细胞的效应作用,逃避免疫监视,促进自身进展。目前,免疫检查点分子PD-1的靶向性治疗抗体已被批准用于治疗顺铂抵抗的复发性或转移性头颈鳞癌,展现出巨大的潜力。然而,临床数据显示,仅有不足20%的头颈鳞癌病人能够对PD-1单克隆抗体免疫治疗产生响应。头颈鳞癌病人肿瘤微环境中存在多重复杂机制实施免疫逃逸,引起免疫抑制,同时导致免疫治疗的不响应。因此,需要持续探索头颈鳞癌发生发展过程中实施免疫逃逸的具体机制,为现有PD-1阻断治疗不响应的头颈鳞癌病人提供新的免疫治疗靶点或联合治疗方式。浆细胞样树突状细胞（plasmacytoid dendritic cell,p DC）是树突状细胞（dendritic cell,DC）的一个亚类,也是专职的I型干扰素（Type I interferon,IFN-I）分泌细胞。p DC可通过大量分泌IFN-I,激活适应性免疫反应,在机体抗病毒免疫中发挥关键作用。然而,近些年研究发现,肿瘤微环境中p DC呈现出细胞功能失调,发挥免疫抑制作用。CD317是一种代表性的IFN-I诱导蛋白,多种类型的肿瘤都存在CD317的高表达。有研究表明,CD317能够与p DC表面受体相互作用,抑制p DC分泌IFN-I等多种细胞因子,介导免疫逃逸。在头颈鳞癌微环境中,肿瘤细胞能否通过CD317与p DC发挥免疫抑制功能,实施免疫逃逸;进一步靶向阻断CD317与p DC之间的联系能否改善头颈鳞癌免疫抑制状态,这些问题需要进一步探索。第一部分头颈鳞癌中浆细胞样树突状细胞的相关研究目的:肿瘤微环境中免疫效应细胞的失能和免疫抑制性细胞的聚集是头颈鳞癌的重要特征之一。p DC在头颈鳞癌中的具体免疫学功能尚不明确。本研究将检测头颈鳞癌中p DC的表型,研究p DC在头颈鳞癌中的浸润情况及临床意义,并分析p DC与微环境中其他免疫相关成分的关系。方法:首先,利用流式细胞术和免疫荧光染色技术检测人类头颈鳞癌组织标本中p DC的成熟相关表型。其次,基于人类头颈鳞癌组织芯片,利用免疫组织化学染色技术及定量分析检测p DC在头颈鳞癌组织中的浸润程度,并与正常黏膜和不典型增生组织中p DC的浸润程度做对比。结合头颈鳞癌病人的生存信息,探究肿瘤中p DC浸润的预后指示意义。进一步将头颈鳞癌病例样本依据HPV感染状态进行分类,在不同HPV感染状态的头颈鳞癌中进行p DC浸润程度的预后分析。另外,利用HPV阳性宫颈鳞癌组织芯片进行免疫组织化学染色检测p DC,并做定量分析。结合病人生存信息进行预后分析,对HPV阳性头颈鳞癌中p DC的预后意义进行验证。最后,对头颈鳞癌组织芯片进行序列切片,同时进行其他免疫相关指标的检测和定量,通过相关性分析,观察HPV阴性的头颈鳞癌样本中p DC的浸润情况与肿瘤微环境的免疫抑制状态之间的关系。结果:头颈鳞癌组织中存在p DC的浸润。对两种经典的p DC标记分子（CD123和CD303）进行比较,结果显示头颈鳞癌中CD123+细胞包含了CD303+细胞在内的其他细胞。CD303+的p DC相较于CD123+细胞表达更低水平的成熟相关分子（包括CD80,CD83和CD86）。相较于正常黏膜和不典型增生组织,p DC在头颈鳞癌中的浸润显著上调。在HPV阴性头颈鳞癌病人中,p DC高度浸润的病人总体生存率显著低于p DC低浸润的病人。然而,在HPV阳性头颈鳞癌和宫颈鳞癌病人中,尽管没有统计学意义,但是p DC高度浸润的病人生存率反而高于低浸润的病人。最后,在HPV阴性头颈鳞癌中,p DC的浸润情况与肿瘤中免疫抑制性指标（包括Foxp-3,PD-1,TIM-3和LAG-3）呈现高度正相关。结论:人类头颈鳞癌中,CD303+p DC更加不成熟。在人类头颈鳞癌微环境中p DC呈现高度浸润。头颈鳞癌中p DC的预后指示作用依据HPV感染状态而异,在HPV阴性的头颈鳞癌中,p DC指示不良预后,并且与肿瘤微环境免疫抑制状态高度正相关。而在HPV阳性的头颈鳞癌和宫颈鳞癌中,p DC可能是病人良好预后的预测指标,但仍需进一步探究。第二部分头颈鳞癌中CD317的相关研究目的:CD317能够与p DC表面受体通过受体与配体相结合的方式,抑制p DC分泌IFN-I等细胞因子。CD317在多种肿瘤中都有表达升高的现象,可能通过抑制p DC的效应功能,介导肿瘤微环境的免疫抑制。目前在头颈鳞癌中,没有相关报道研究CD317的免疫相关特征。本研究将探究CD317在人类及小鼠头颈鳞癌中的表达,临床意义。同时分析CD317与肿瘤微环境免疫相关特征的关系。方法:利用生物信息学方法分析Oncomine及癌症基因组图谱（the Cancer Genome Atlas,TCGA）数据,初步探究CD317 m RNA在多种肿瘤中的表达情况。利用人类头颈鳞癌组织标本,进行CD317,CD11b,CD3和DAPI的多标记免疫荧光染色,判断CD317在头颈鳞癌组织中的细胞定位。利用人类头颈鳞癌组织芯片进行免疫组织化学染色和定量分析,进一步验证头颈鳞癌中CD317蛋白水平的表达。结合头颈鳞癌病人的临床病理参数信息,探究CD317在头颈鳞癌病人中的预后指示作用。检测CD317在多种头颈鳞癌小鼠模型（Tgfbr1单基因敲除鼠、Pten单基因敲除鼠、Tgfbr1/Pten双基因敲除鼠以及野生型小鼠）肿瘤组织中的表达。利用TCGA数据进行基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis,GSEA）,研究CD317在头颈鳞癌微环境中的免疫学特征。利用人类头颈鳞癌组织芯片以及Tgfbr1/Pten双基因敲除鼠头颈鳞癌肿瘤标本,进行序列切片和免疫组织化学染色,检测其他免疫相关指标并进行定量分析,通过相关性分析观察CD317与头颈鳞癌微环境免疫抑制状态的关系。结果:在包括头颈鳞癌在内的多个肿瘤类型中,CD317的m RNA表达水平都有显著上调。在头颈鳞癌病人队列研究中,CD317主要表达于肿瘤细胞,同时在肿瘤间质的髓系细胞上也有表达。相对于正常口腔黏膜和不典型增生组织,在头颈鳞癌组织中CD317的总体表达水平明显上调。同时,CD317高表达的头颈鳞癌病人总体生存时间短于CD317低表达的病人。基于TCGA数据,经GSEA分析发现,头颈鳞癌中CD317的表达与负性内源性免疫反应和负性适应性免疫反应的基因集呈现高度正相关。在人类和小鼠头颈鳞癌标本中,CD317的表达与肿瘤微环境中发挥免疫抑制功能的指标呈显著正相关。结论:CD317在人类及小鼠头颈鳞癌中表达升高。CD317的高表达的头颈鳞癌病人较低表达病人预后更差。人类及小鼠头颈鳞癌中CD317的高表达与肿瘤微环境中免疫抑制状态高度正相关。第三部分靶向阻断CD317与pDC增强抗肿瘤免疫的研究目的:第一和第二部分的研究结果指出:头颈鳞癌中存在p DC高度浸润同时CD317高表达,结合相关文献表明CD317可以抑制p DC的免疫活化功能。因此我们推测,头颈鳞癌可能通过CD317和p DC相互作用实施免疫逃逸。此部分研究将在头颈鳞癌转基因鼠模型中,利用抗体靶向阻断CD317和p DC的相互作用,观察治疗效果;另外前两部分研究指出,头颈鳞癌中CD317和p DC与免疫检查点分子和免疫抑制性细胞呈显著正相关。因此,此部分将探究该治疗对发挥效应功能的T细胞以及对免疫抑制性细胞的影响,明确CD317和p DC在头颈鳞癌免疫调控中发挥的相关作用。方法:利用HPV阴性Tgfbr1/Pten双基因敲除鼠构建头颈鳞癌小鼠模型,体内给予CD317单克隆抗体进行治疗。观察并对比实验组与对照组小鼠肿瘤的生长情况。在动物实验终点,取小鼠外周淋巴器官及肿瘤组织进行流式细胞术检测,评估实验组与对照组小鼠免疫表型的变化,包括p DC,T细胞,调节性T细胞（Treg）,髓源性抑制细胞（MDSC）等数量及比例的改变。同时检测两组小鼠T细胞表面免疫检查点表达的变化。另外,对小鼠肿瘤组织进行免疫组织化学染色,检测相应免疫细胞和免疫检查点分子的变化。利用小鼠头颈鳞癌SCC7细胞系通过稳定转染技术,敲低CD317的表达并接种至重度免疫缺陷型NOG小鼠皮下,观察CD317敲除组与对照组小鼠肿瘤的生长情况。结果:应用CD317单克隆抗体靶向阻断后,Tgfbr1/Pten 2c KO小鼠肿瘤生长速度减缓。流式分析结果表明,CD317靶向阻断组小鼠中p DC的比例显著下降。同时CD317靶向阻断组中,小鼠体内的T细胞比例明显增加,T细胞表面的免疫检查点分子,如PD-1,TIM-3,和LAG-3的表达降低。另外,小鼠体内Treg和单核型MDSC的比例也有所降低。重度免疫缺陷型NOG小鼠中,敲低CD317的SCC7移植瘤,其生长速度与对照组相比无明显差异。结论:在HPV阴性头颈鳞癌小鼠模型中,CD317单克隆抗体靶向阻断治疗,能够增加荷瘤小鼠T细胞的比例并降低免疫抑制性细胞的比例,同时抑制肿瘤的生长。然而,在没有免疫系统干扰的条件下,CD317对头颈鳞癌的进展并不起作用。因此,CD317单克隆抗体可以通过阻断CD317和p DC的相互作用,进而改善荷瘤小鼠的免疫抑制状态,从而抑制肿瘤的进展。