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细胞外突(cell protrusions)根据形状分为片状伪足、丝状伪足等,常见于细胞迁移和吞噬。在细胞迁移和吞噬过程中,细胞通过成核促进因子如WAVE、WASP等激活肌动蛋白成核复合物Arp2/3或formins,生成网状或丝状肌动蛋白并引起肌动蛋白聚合,以此提供细胞外突的力。研究发现,除了肌动蛋白聚合通路外,细胞外突还能够被网格蛋白重链(Clathrin heavy chain,CHC)抑制。网格蛋白在胞吞作用中研究较为广泛,但其在外突机制的研究比较少。有报道认为蜕皮激素(20-hydroxyecdysone,20E)能够促进昆虫免疫细胞的吞噬作用并加速血细胞运动,但其中的分子机制未知。棉铃虫(Helicoverpa armigera)是一种代表性的重要农业害虫,本论文研究以棉铃虫为材料,探究20E诱导细胞外突的分子机制。在本研究中,首先使用20E处理棉铃虫6龄早期幼虫,通过电镜对血细胞形态进行观察,发现20E处理后的血细胞产生外突,而未经20E处理的血细胞没有此现象。随后运用荧光显微镜观察,结果表明F-actin的表型与细胞形态一致,表现为向外突出,据此初步认为20E能够促进血细胞外突。在此基础上,使用RNAi沉默血细胞中的CHC和网格蛋白轻链(Clathrin light chain,CLC)基因,在无20E诱导情况下,CHC RNAi引起血细胞F-actin聚集并明显向外突出,进一步的20E处理显著增加外突的长度,表明CHC抑制细胞外突。相反,CLC RNAi导致20E诱导的外突显著减少,同时黏着斑增加,表明CLC起促进细胞外突的作用。因此,网格蛋白在20E诱导的血细胞外突过程中发挥重要功能,且CLC和CHC的作用方式不同。肌动蛋白的组装受到成核蛋白Arp2/3复合物的催化,并由此实现细胞形态及运动的快速变化,暗示20E诱导的棉铃虫血细胞外突可能也与Arp2/3有关。通过原核表达,分别制备出棉铃虫CLC、CHC和Arp2/3的多克隆抗体,Western blot检测了CLC、CHC和Arp2/3在蛋白水平上的表达模式,结果发现CLC在6龄幼虫蜕皮后12h最低,随后不断上升,72h达到最高,与20E滴度的变化正相关;而CHC及Arp2/3则与之不同。20E诱导实验进一步说明了20E能够诱导CLC的表达。棉铃虫体内20E处理,对血细胞CLC及Arp2/3进行免疫共沉淀的实验结果发现,20E诱导CLC与Arp2/3相互作用。当20E滴度降低时,血细胞未发生外突现象,且CLC与Arp2/3的相互作用下降直至消失。使用免疫组化技术对CLC和Arp2/3进行亚细胞定位,相比于对照组,20E处理后的血细胞中CLC及Arp2/3向细胞膜表面聚集,并且高度重合。本论文研究表明,20E能够通过网格蛋白调节棉铃虫血细胞的外突。在这个过程中,网格蛋白的轻链(CLC)与重链(CHC)承担着不同的功能,即20E通过CLC促进细胞外突,CLC在20E的作用下与成核蛋白Arp2/3结合,共同调节血细胞形变,形成细胞外突。