蛴螬(Grubs)为金龟子科朝鲜黑金龟子的幼虫,首次记录于《神农本草经》,后被《本草纲目》、《金匮要略》等典籍收载。研究表明,蛴螬提取物具有抑制细菌生长、抑制肿瘤、保护肝脏、溶解血栓等功效,蛴螬多肽使蛴螬的提取成分之一,其具有一定的抗氧化能力、对肿瘤的生长有一定的抑制作用等药理活性,但其提高免疫力方面研究较少。本研究拟为蛴螬为原料,采用蛋白酶酶解和超滤、层析、电泳等方法提取纯化鉴定蛴螬多肽(Grubs Polypeptides),通过免疫抑制小鼠模型和免疫性肝损伤小鼠模型,探讨蛴螬多肽对小鼠免疫抑制调节作用及免疫性肝损伤的保护作用,预期研究成果为蛴螬开发为免疫调节药物提供试验依据。1试验一目的提取纯化及鉴定蛴螬多肽,为探讨其对免疫功能影响的奠定物质基础。取干燥蛴螬粉碎,采用木瓜蛋白酶解蛴螬,超滤和离子层析法分离纯化蛴螬的提取物蛴螬多肽,Tricine-SDS-PAGE法鉴定其分子大小;使用分光光度法分析蛴螬多肽的抗氧化能力,其中重要的一项抗氧化指标是其对酰基自由基的清除能力。结果提取的蛴螬多肽浓度为37.01mg/mL、提取率达18.66%、分子量小于10KDa,对酰自由基清除达到42.84%。结果表明通过酶解分离纯化后获得小分子蛴螬多肽,其具有良好的清除酰自由基能力。2试验二目的探讨制备的蛴螬多肽对环磷酰胺(CTX)致免疫抑制小鼠免疫功能的影响。取小鼠随机分对照组、模型组和不同剂量蛴螬多肽组(50、100、200mg/kg)。蛴螬多肽组小鼠每天一次灌胃蛴螬多肽、对照组和模型组小鼠每天灌服等量的生理盐水,连续20天,试验结束前三天除对照组外所有小鼠腹腔注射CTX,每天一次连续3天,试验结束后,取小鼠称重、采血制备血清,无菌操作制备小鼠腹腔、脾脏、骨髓细胞培养;通过称重、分光光度法、血细胞分析仪、流式细胞技术等方法分析小鼠脏器指数、白细胞数量、迟发型超敏反应、腹腔巨噬细胞吞噬能力、淋巴细胞增殖和分泌因子、血清溶血素含量。结果与对照组比较,模型组小鼠肝脏、脾脏和胸腺指数明显降低;白细胞数和血清溶血素含量明显降低;淋巴细胞增殖和分泌NO含量明显降低;巨噬细胞的吞噬率显著下降;小鼠耳肿胀程度明显降低。与模型组比较,蛴螬多肽组小鼠脏器指数显著提高,白细胞数和血清溶血素含量逐渐升高,淋巴细胞增殖和分泌NO的含量显著提高接近正常组;巨噬细胞的吞噬能力显著增强,小鼠耳肿胀程度有所缓解。结果显示,蛴螬多肽可以显著增强免疫抑制小鼠免疫功能,表明蛴螬多肽能提高CTX诱导的免疫抑制小鼠的特异性及非特异性免疫功能。3试验三目的探讨提取的蛴螬多肽对刀豆蛋白A(ConA)致免疫性肝损伤小鼠的保护作用。将小鼠随机分为对照组、模型组和不同剂量蛴螬多肽组。蛴螬多肽组小鼠每天一次灌胃蛴螬多肽、对照组和模型组小鼠每天灌服等量的生理盐水,连续10天,试验结束前8h除正常组外所有小鼠尾静脉注射ConA,试验结束后,将小鼠称重、眼球采血制备血清,取出肝脏和脾脏并称重、称取一部分肝脏制备匀浆液,另取一部分肝脏用多聚甲醛固定、制备组织切片;通过称重、HE染色、分光光度法、ELISA、PR-PCR等方法分别分析小鼠脏器指数,检测肝功能指标、过氧化物含量、抗氧化酶活力、炎症因子蛋白和基因表达水平等,显微镜观察肝组织结构。结果与对照组比较,模型组脏器指数明显升高;小鼠肝组织中肝小叶组织模糊,肝细胞大量坏死,肝窦中有大量瘀血;血清中肝功能酶(ALT、AST)含量明显升高;肝组织中过氧化物丙二醛(MDA)含量明显增加,抗氧化酶(CAT、SOD、GSH-Px)活力显著降低;炎症因子(TNF-α、IL-6、iNOS)蛋白与基因水平表达都显著提高。与模型组相比,蛴螬多肽组小鼠脏器指数明显降低;肝细胞无明显坏死和变性;血清中ALT、AST含量显著降低;肝脏中抗氧化酶活力显著升高,过氧化物含量明显降低;血清中炎症因子蛋白与基因表达水平均显著降低。结果显示,蛴螬多肽显著降低免疫性肝损伤小鼠的肝功能,明显增强肝组织的抗氧化酶活力、降低氧化物产生,减少炎症因子的产生,表明蛴螬多肽具有一定抗炎、抗氧化作用,对免疫性肝损伤小鼠有一定保护功能。综上所述,本研究通过提取纯化获得小分子量蛴螬多肽,发现其能提高免疫抑制小鼠特异及非特异性免疫功能,对免疫性肝损伤小鼠有一定的保护功能。