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哮喘是一种多种炎症细胞参与的慢性气道炎症性疾病,其主要特征是慢性炎症、气道高反应性和气道重塑。气道重塑包括气道壁杯状细胞增多、平滑肌细胞和成纤维细胞超常增生、胶原沉积、基底膜增厚、血管增生等。气道重塑已经成为哮喘研究的主要焦点。射麻止喘方是课题组多年来治疗哮喘的经验方,应用于临床效果显著。本课题拟在前期的研究基础上,从分子生物学水平,在治疗哮喘的作用机理方面做进一步的探索。目的借助哮喘气道重塑大鼠模型,从哮喘气道平滑肌增生、细胞外基质平衡入手,利用免疫组化、qRT-PCR.ELISA等技术检测哮喘气道重塑大鼠肺组织MMP-9.TGF-β1、 Smad3、Smad7的蛋白和基因以及血清OPN、PAI-1表达水平的变化,探讨加味射麻止喘方对气道重塑的影响及作用机理方法将72只SPF级SD大鼠随机分为空白组(A)、模型组(B)、中药高剂量组(C)、中药中剂量组(D)、中药低剂量组(E)及地塞米松组(F),每组12只。以卵清蛋白(OVA)致敏和激发建立哮喘气道重塑大鼠模型。除空白组外,各组大鼠在第1、8天腹腔注射lml OVA/AL(OH)3混合液(含OVA10mg和AI(OH)3200mg)致敏,第15天开始应用超声雾化器于自制简易雾化箱中以一定浓度的OVA生理盐水溶液雾化激发,每次20min,隔日1次,持续8周。激发浓度分别为第1、2周1%,第3、4周1.5%,第5、6周2%,第7、8周2.5%。每次激发前半小时给药,各中药组按40g/kg、20g/kg、10g/kg的剂量予以加味射麻止喘方中药灌胃,地塞米松组则以0.5mg/kg灌胃。空白组在第1、8天给予生理盐水代替OVA/AL(OH)3混合液腹腔注射,第15天开始以生理盐水代替OVA超声雾化吸入,每次30min,每周3次,持续8周。并且每次雾化前0.5h开始用生理盐水代替药物灌胃。末次给药后2h,用10%水合氯醛350mg/kg腹腔注射麻醉,腹主动脉抽血后处死,开胸结扎,迅速取左肺中叶组织块置于冻存管中-80℃冻存,用于RNA抽提；取出右肺,用4%多聚甲醛灌注及固定,石蜡包埋,用于HE染色及免疫组化检查,血液离心后取血清用于ELISA检查。大鼠肺组织HE染色在光学显微镜放大100倍下找到完整的细支气管横断面,采集图像,评定肺组织病理形态学改变。再用医学图像分析系统测量分析支气管内管壁标化面积、平滑肌标化面积。免疫组化法检测肺组织MMP-9、TGF-β1、Smad3、Smad7蛋白表达,荧光定量PCR检测MMP-9、TGF-β1、Smad3、Smad7mRNA表达,ELISA法检测OPN、PAI-1水平。结果1.肺组织病理学改变：模型组可见大量炎症细胞浸润,上皮细胞脱落,气道粘膜水肿,上皮下纤维化,平滑肌增厚。各中药高、中、低剂量组与模型组相比,以上改变明显减轻,与地塞米松组相比,无显著性差异。2.镜下肺组织气道形态学指标改变：图像分析结果表明在支气管内管壁标化面积(WAm/Pbm)、平滑肌标化面积(WAi/Pbm)上,模型组均高于其他各组(p<0.01),各治疗组均较模型组明显减轻,但仍高于空白组(p<0.01)。除高剂量组与地塞米松组比较有差异外(p<0.05),中、低剂量组与地塞米松组比较差异无统计学意义(p>0.05)。3.肺组织MMP-9蛋白及基因表达情况：免疫组化结果显示,MMP-9在空白组肺组织气道周围有较少的阳性着色。与空白组相比,模型组MMP-9蛋白表达明显增强(p<0.01)。与模型组相比,高剂量组MMP-9表达PU值明显减轻(p<0.01),地塞米松组剂量组也有所改善(p<0.01),中、低剂量组改善程度不显著(p>0.05)。qRT-PCR结果显示,以空白组表达量作为参照,其余各组MMP-9mRNA相对表达量都有所上升,其中模型组表达量是空白组的3.02倍,中药高剂量组是空白组的1.10倍,中剂量组是空白组的1.11倍,低剂量组是空白组的1.50倍,地塞米松组是空白组的1.31倍。与模型组相比,中药高、中剂量组表达量都有所改善(p<0.05)。中药低剂量组、地塞米松组虽有所改善,但无统计学意义(p>0.05)。4.血清OPN及PAI-1的水平：ELISA分析结果显示：(1)模型组血清OPN水平高于空白组(p<0.05),中药高剂量组PAI-1水平均较模型组明显减轻(p<0.05),仍高于空白组,但无统计学意义(p>0.05)。中药中剂量组、低剂量组、地塞米松组较模型组有所下降,但无统计学意义(p>0.05)。(2)模型组血清PAI-1水平高于空白组(p<0.01),中药高剂量组PAI-1水平均较模型组明显减轻(p<0.01),中药中、低剂量组也较模型组减轻(p<0.05),中药各组仍高于空白组,但无统计学意义(p>0.05)。地塞米松组较模型组有所下降,但无统计学意义(p>0.05)。5.肺组织TGF-β1、Smad3、Smad7蛋白及基因表达：免疫组化结果显示：(1) TGF-β1在空白组肺组织气道周围有非常少的阳性着色。与空白组相比,模型组TGF-β1表达明显增强(p<0.01)。与模型组相比,中药高、中剂量组和地塞米松组表达明显减轻(p<0.01),低剂量改善程度不显著(p>0.05)。(2) Smad3在空白组肺组织气道周围有较少的阳性着色。与空白组相比,模型组Smad3表达明显增强(p<0.01)。中药高、中剂量组和地塞米松组阳性染色程度较模型组明显减轻(p<0.05),中药高、中剂量组与地塞米松组间差异无统计学意义(p>0.05),中药低剂量组虽有所减轻,但无统计学意义(p>0.05)。(3) Smad7蛋白在空白组肺组织气道周围有较多阳性着色。与空白组相比,模型组Smad7表达明显减弱(p<0.01)。与模型组相比,各治疗组表达明显增强(p<0.01)。中药高剂量组与地塞米松组相比,差异有统计学意义(p<0.05),中药中、低剂量组与地塞米松相比,差异无统计学意义(p>0.05)。QRT-PCR结果发现：(1)以空白组TGF-β1mRNA表达量作为参照,其余各组TGF-β1mRNA相对表达量都有所上升,其中模型组表达量是空白组的5.25倍,与空白组差异有显著性(p<0.01)。中药高剂量组是空白组的2.33倍,中剂量组是空白组的3.00倍,低剂量组是空白组的4.26倍,地塞米松是空白组的1.96倍。与模型组相比,中药高剂量组、中剂量组、地塞米松组表达量都有所下调,有统计学意义(p<0.01,p<0.05,p<0.01),中药低剂量组虽有所下调,但差异无统计学意义(p>0.05)。(2)以空白组Smad3mRNA表达作为参照,模型组Smad3mRNA表达是空白组的2.70倍,与空白组比较,差异有显著性(p<0.01)。中药高剂量组是空白组的1.11倍,中药中剂量组是空白组的1.29倍,中药低剂量组是空白组的1.15倍,三组与模型组相比,有显著性差异(p<0.01,p<0.05,p<0.01)。地塞米松组是空白组的1.78倍,虽有所改善,但无统计学差异(p>0.05)。(3)以空白组Smad7mRNA表达作为参照,模型组Smad7mRNA表达是空白组的0.23倍,但与空白组比较,差异无统计学意义(p>0.05)。中药高剂量组是空白组的2.09倍,中药中剂量组是空白组的2.12倍,此二组与模型组相比,差异有统计学意义(p<0.01)。中药低剂量组是空白组的1.07倍,地塞米松组是空白组的0.76倍,此二组与模型组相比,差异无统计学意义(p<0.05)。结论1.加味射麻止喘方能够减轻哮喘气道的厚度及气道平滑肌的厚度,改善气道重塑。2.加味射麻止喘方能够通过下调肺组织MMP-9的表达,调节大鼠肺组织MMP-9/TIMP-1平衡,减少细胞外基质,从而达到改善哮喘气道重塑的目的。3.加味射麻止喘方能够通过下调OPN、PAI-1炎症因子水平,调控细胞外基质的动态平衡,抑制平滑肌细胞和成纤维细胞等的迁移和增殖,从而改善气道重塑.4.加味射麻止喘方能够通过调控TGF-β1/Smad信号通路的关键元件,抑制TGF-β1信号向胞浆和胞核的转录,减少胶原纤维沉着和气道上皮纤维化,从而改善气道重塑。