小兰屿蝴蝶兰FtsHs基因功能及其分子机理研究

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叶绿体的稳态直接影响植物的光合效率,而蛋白酶在维持叶绿体稳态的过程中发挥了重要作用。Fts H蛋白酶是由核编码的一种定位于内共生起源的叶绿体膜或线粒体膜的ATP和Zn2+依赖型蛋白,其中叶绿体Fts H蛋白酶的主要功能是参与类囊体的发育以及降解PSⅡ中因电子传递受损的D1蛋白。小兰屿蝴蝶兰为天门冬目兰科蝴蝶兰属单子叶CAM植物,小兰屿蝴蝶兰共有7个Fts H成员。其中Pe Fts H1与At Fts H1、5(A型亚基)双基因聚类在一起,Pe Fts H2与At Fts H2、8(B型亚基)双基因聚类一起。通过烟草VIGS发现当Nb Fts H、Nb Fts H2下调时,叶片出现不同程度的黄化,尤其是Nb Fts H2下调后,叶片黄化更为明显,并且出现早衰。在P.equestris中VIGS发现当Pe Fts H1、Pe Fts H2基因表达下调后,植株光合能力下降、类囊体发育受损,且Pe Fts H1、Pe Fts H2均能挽救var1、var2的表型,说明其与拟南芥基因功能具有同源性。通过膜蛋白酵母双杂交(DUAL membrane)、双分子荧光互补(Bimolecular Fluorescent Complimentary,Bi FC)、免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,COIP)、蓝绿温和凝胶电泳(Blue Native-PAGE)与质谱联用验证Pe Fts H1、Pe Fts H2同样是以形成六聚体,但以2:1的亚基组成比例行使生物学功能,因此Fts H聚合物的亚基种类数量少于拟南芥;通过蛋白体外结合实验(pull down)实验发现两个叶绿体Fts H蛋白与PSⅡD1、D2蛋白的结合能力具有差异,Pe Fts H2能与PSⅡD1、D2体外结合。总之,通过揭示小兰屿蝴蝶兰叶绿体Fts H基因的功能与分子机制,为蝴蝶兰乃至兰科植物叶片光合作用的基础研究奠定理论基础。线粒体稳态直接影响细胞凋亡、自噬等活动,进而决定细胞命运。其中线粒体Fts H蛋白酶在维持线粒体稳态中发挥了重要作用。P.equestris共有3种线粒体Fts H蛋白酶,其中Pe Fts H5为At Fts H4的同源基因,具有Fts H基因家族所特有的domain,定位于线粒体,通过烟草VIGS发现当Pe Fts H5在N.benthamiana中的同源基因Nb Fts H5下调后,植物叶片细胞出现SA水平上调,抗病性增强,但同时也对细胞造成了一定的损伤;在P.equestris中下调Pe Fts H5基因后,积累的SA加速了细胞凋亡与ROS积累,但提高了植株抵御生物胁迫的能力。由于Fts H蛋白酶家族具有形成聚合物的特征,通过DUAL membrane发现,Pe Fts H5(i-AAA)只与自身互作,形成聚合物,不与其他两种线粒体Fts H蛋白酶互作。表明在P.equestris细胞中,线粒体Fts H蛋白酶是形成同型聚合物发挥功能,符合i-AAA型蛋白酶的特征。总之,通过对Pe Fts H5基因功能及其分子机理的研究,对揭示蝴蝶兰线粒体蛋白酶对线粒体稳态的调控机制以及培养蝴蝶兰抗病品种,奠定了理论基础。
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