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类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA）是一种以滑膜炎症、关节骨与软骨破坏为主要特征的慢性、全身性自身免疫病。它会导致关节强直、畸形和功能丧失。同时也会对心、肺、肾等多个器官和系统造成损害,严重危害患者的健康和生活质量。RA的全球患病率为0.24%。目前其发病机制尚未明确,RA的发病起源于关节邻近的滑膜组织,然后向软骨和骨扩散,其中滑膜衬里层的成纤维样滑膜细胞（fibroblast-like synoviocytes,FLS）在RA发病过程中的扮演着至关重要的作用。在RA的炎症过程中,活化的FLS展现出类似肿瘤细胞的生物学行为,其迁移,侵袭能力明显增强。RA-FLS在多种炎症介质和细胞因子作用下,迁移至骨和软骨的表面,并产生蛋白水解酶,导致软骨和骨的侵蚀以及关节的破坏。活化的RA-FLS还可以迁移到远处关节炎症部位,对多关节的破坏具有一定的影响,因此阐明RA-FLS迁移,侵袭的分子机制十分必要,并且可能为RA早期治疗寻找新靶点。环状RNA（circular RNA,circRNA）是一类不具有5’末端帽子和3’polyA尾的以共价键形成的闭合环状结构的RNA分子。CircRNA广泛存在于真核细胞中,结构稳定,具有组织特异性、疾病特异性和时序特异性等特点。CircRNA能参与调节许多疾病的发生发展。它们可通过作为“微小RNA（microRNA,miRNA）”海绵、调控结合蛋白、调控基因转录,少数circRNA还可以编码蛋白等方式参与基因表达。我们通过RA-FLS及骨关节炎成纤维样滑膜细胞（Osteoarthritis fibro-blast-like synoviocytes,OA-FLS）的circRNA芯片技术和后续细胞验证实验,挑选了 Circ0088194作为研究对象。随后研究了 Circ0088194对RA-FLS迁移,侵袭的影响,将“miRNA”海绵机制作为切入点,探索Circ0088194在RA发生发展中的作用,为RA的治疗找寻潜在的治疗靶点。本课题分为以下4个部分:第一部分:RA-FLS中的环状RNA表达谱研究目的:检测人类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞与骨关节炎成纤维样滑膜细胞中差异表达明显的circRNA。方法:选取3例RA滑膜组织与3例与之年龄性别相匹配的OA滑膜组织。分别分离培养出RA-FLS和OA-FLS。通过环状芯片技术检测其中差异表达的circRNA。设计跨剪切位点的特殊的circRNA引物,利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）对芯片结果进行验证。通过sanger测序,验证差异表达的circRNA是否成环。通过Spearman秩相关分析评价circRNA与RA患者DAS28评分的关系。最后,通过RNA荧光原位杂交技术对circRNA进行亚细胞定位。结果:1.在RA-FLS和OA-FLS的环状芯片中,共有7个circRNA表达差异较为明显,其中85.7%来源于外显子。2.验证实验发现了2个circRNA（Circ0088194,Circ0088200）在RA-FLS中表达升高,Circ0088194的表达升高更显著。3.Sanger 测序证实序列中包含一段 tcactgccaagttcacaacagaagccgaaccggaagttgac的接头序列。4.Circ0088194 与 DAS28 评分相关（r=0.683,p=0.043）。5.通过RNA荧光原位杂交发现Circ0088194主要定位在RA-FLS的细胞质中。结论:与OA-FLS相比,Circ0088194在RA-FLS中表达升高,并与RA患者的疾病活动度相关,提示Circ0088194可能在RA疾病发展过程中扮演重要角色。第二部分:Circ0088194对RA-FLS迁移,侵袭功能的影响目的:研究Circ0088194对RA-FLS迁移,侵袭功能的影响。方法:1.构建Circ0088194过表达腺病毒载体,将其转染至RA-FLS中,通过qRT-PCR验证Circ0088194的表达水平,以保证过表达载体的有效性。2.过表达Circ0088194后,通过Transwell细胞迁移,侵袭实验,观察RA-FLS迁移,侵袭功能的变化。3.设计3条针对Circ0088194的小干扰RNA（siRNA）,通过qRT-PCR验证Circ0088194的表达水平,确保干扰效率。4.挑选干扰效率最高且稳定的1条siRNA,将其转染至RA-FLS中,再通过Transwell细胞迁移,侵袭实验,观察RA-FLS迁移,侵袭功能的变化。结果:1.与空载体相比,转染Circ0088194过表达腺病毒载体后,在RA-FLS中,Circ0088194的表达水平明显升高。2.转染Circ0088194过表达腺病毒载体后,与空载体相比,RA-FLS的迁移,侵袭能力明显增强。3.与阴性对照相比,3条siRNA均可不同程度地敲低Circ0088194的表达水平,其中si Circ0088194#1最明显。4.转染si Circ0088194#1后,与阴性对照组相比,RA-FLS的迁移,侵袭能力明显减弱。结论:过表达Circ0088194可明显促进RA-FLS的迁移,侵袭能力。第三部分:Circ0088194调控RA-FLS迁移,侵袭机制研究3.1 Circ0088194通过调控MMP2的表达促进RA-FLS的迁移,侵袭目的:研究Circ0088194调控的下游关键基因。方法:1.选取3例过表达Circ0088194腺病毒载体和空载体的RA-FLS,通过蛋白芯片技术检测其中差异表达的蛋白。2.利用qRT-PCR对蛋白芯片中表达差异明显的蛋白进行mRNA水平验证。3.通过qRT-PCR、Western blot实验,分析过表达或干扰Circ0088194后,RA-FLS中基质金属蛋白酶2（MMP2）的表达水平变化。4.共转染Circ0088194过表达腺病毒载体和MMP2的siRNA,通过qRT-PCR、Western blot实验和Transwell细胞迁移,侵袭实验分别检测MMP2的表达水平的变化以及对RA-FLS迁移,侵袭功能的影响。结果:1.蛋白芯片提示共有13个蛋白有显著差异表达,其中4个蛋白表达上调,9个蛋白表达下调。2.验证实验发现过表达Circ0088194后,仅MMP2 mRNA在RA-FLS中表达升高,其余两个蛋白（TNF-α转化酶（TACE）,血小板衍生生长因子AA（PDGF-AA））的mRNA表达水平无明显差异。3.与空载体组相比,过表达Circ0088194后,MMP2 mRNA及蛋白水平均升高;而干扰Circ0088194后,MMP2 mRNA及蛋白表达水平下降。4.与单独过表达Circ0088194相比,共转MMP2的siRNA能抑制MMP2 mRNA及蛋白表达水平,并能阻断Circ0088194对RA-FLS迁移,侵袭功能的促进作用。结论:Circ0088194可以通过调控MMP2的表达促进RA-FLS的迁移,侵袭。3.2 Circ0088194 在 RA-FLS 中可充当 miR-766-3p 的分子海绵目的:研究Circ0088194调控的下游miRNA。方法:1.通过 miRanda,Circular RNA interactome 和 Targetscan 数据库,采用生物信息学分析预测能同时与Circ0088194和MMP2 mRNA两者结合的miRNA。2.通过qRT-PCR检测分别过表达和干扰Circ0088194后miRNA的表达水平。3.根据生物信息学网站预测出的miRNA与Circ0088194的结合位点,构建Circ0088194 3’非翻译区（3’untranslated regions,3’UTR）区域结合位点野生型以及突变体质粒,克隆至荧光载体。通过双荧光素酶报告基因实验,验证miRNA与Circ0088194是否结合。4.Argonaute 2（AGO2）免疫共沉淀后通过qRT-PCR验证了 miRNA与Circ0088194直接的相互作用。5.转染Circ0088194野生型（wild-type,WT）和突变型（mutant-type,MUT）,通过 Transwell 细胞迁移,侵袭实验,观察RA-FLS迁移,侵袭功能的变化。结果:1.通过生物信息学预测了 2个能同时与Circ0088194和MMP2 mRNA结合的miRNA,挑选miR-766-3p进行研究。2.与空载体相比,过表达Circ0088194可下调miR-766-3p的表达;相反,干扰Circ0088194后,miR-766-3p的表达水平上调。3.荧光素酶报告基因实验证明miR-766-3p与Circ0088194可结合性。同时加入 Circ0088194-WT 和 miR-766-3p mimics 后,RA-FLS 的荧光量显著减低。4.AGO2特异性抗体可以从细胞裂解物中沉淀AGO2蛋白,Circ0088194和miR-766-3p在AGO2免疫沉淀物中高度富集。5.突变Circ0088194与miR-766-3p结合位点后,RA-FLS迁移,侵袭功能明显下降,与空载体组的迁移,侵袭能力相比无明显差异。结论:Circ0088194可充当miR-766-3p的分子海绵。3.3 miR-766-3p靶向调控MMP2抑制RA-FLS的迁移,侵袭目的:验证miR-766-3p靶向调控MMP2抑制RA-FLS的迁移,侵袭。方法:1.分别构建过表达和干扰miRNA的载体,通过qRT-PCR和Western blot实验检测过表达和干扰miRNA后,RA-FLS中MMP2的表达水平的变化。2.通过双荧光素酶报告基因实验,验证miRNA是否能与MMP2 mRNA3’UTR区域结合。3.分别过表达和干扰miRNA后,通过Transwell细胞迁移,侵袭实验,观察RA-FLS迁移,侵袭功能的变化。结果:1.过表达miR-766-3p后,MMP2 mRNA及蛋白表达水平明显下降;而干扰miR-766-3p可上调MMP2 mRNA及蛋白的表达水平。2.荧光素酶报告基因实验证明了 miR-766-3p能与MMP2 mRNA的3’UTR区域结合。3.过表达miR-766-3p后可抑制RA-FLS的迁移,侵袭能力。反之,干扰miR-766-3p可促进RA-FLS的迁移,侵袭能力。结论:miR-766-3p靶向调控MMP2抑制RA-FLS的迁移,侵袭能力3.4 Circ0088194 通过 miR-766-3p/MMP2 轴促进 RA-FLS 的迁移,侵袭功能目的:验证Circ0088194通过miR-766-3p/MMP2轴促进RA-FLS迁移,侵袭功能方法:1.同时转染Circ0088194过表达腺病毒载体和miR-766-3p过表达载体,通过qRT-PCR、Western blot实验分别检测MMP2的表达水平的变化。2.同时转染Circ0088194过表达腺病毒载体和miR-766-3p过表达载体行Transwell细胞迁移,侵袭实验,观察RA-FLS迁移,侵袭功能的变化。结果:1.与单独转染Circ0088194相比,同时转染miR-766-3p可阻断转染Circ008819对MMP2表达的上调作用。2.与单独转染Circ0088194相比,同时转染miR-766-3p可阻断Circ0088194对RA-FLS迁移,侵袭的促进作用。结论:Circ0088194通过miR-766-3p/MMP2功能轴促进RA-FLS的迁移,侵袭。第四部分:Circ0088194在类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞中的N6-甲基腺苷修饰目的:检测RA-FLS中Circ0088194的N6—甲基腺苷（m6A）修饰水平及其对Circ0088194稳定性的影响方法:1.运用qRT-PCR检测m6A修饰中最重要的四种酶（METL3,METTL14,FTO和ALKBH5）在RA-FLS及OA-FLS中的表达水平。2.通过m6A免疫沉淀法和RT-qPCR技术验证RA-FLS及OA-FLS中m6A修饰水平。结果:1.METL3 mRNA和ALKBH5 mRNA在RA-FLS中表达升高,其余两种酶（METTL14,FTO）的mRNA表达水平在两者间无统计学差异。2.Circ0088194在RA-FLS中存在m6A修饰,但m6A修饰水平在两者间无统计学差异。结论:Circ0088194在RA-FLS中存在m6A修饰,但其可能不足以影响Circ0088194 稳定性。