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第一部分miR-302b在骨肉瘤中的表达差异及临床相关性研究目的:探讨miR-302b在骨肉瘤组织和骨肉瘤细胞中的表达差异,以及miR-302b与骨肉瘤患者临床参数之间的相关性。方法:取骨肉瘤患者术中标本31例,RT-PCR检测肿瘤组织和瘤旁组织标本的miR-302b表达差异。RT-PCR检测骨肉瘤细胞系(MG63、U2OS、143B、Sao2)和成骨细胞系(人hFOG1.19、小鼠MC3T3-E1)的miR-302b相对表达量。收集骨肉瘤患者的临床信息,包括年龄、性别、肿瘤部位、转移与否、骨肉瘤病理分级。以骨肉瘤瘤体组织miR-302b表达量中位数为分界,将骨肉瘤患者分为miR-302b高表达组(>0.81)和miR-302b低表达组(≤0.81),并分析miR-302b表达量与骨肉瘤患者临床特征的相关性。结果:骨肉瘤瘤体组织中miR-302b表达量(0.805±0.026)低于瘤旁组织(2.822±0.194),差异有统计学意义(n=31,t=10.29,P<0.001);MG63、U2OS、143B、Sao2细胞中的miR-302b相对表达量分别为0.973±0.071,1.239±0.092,0.620±0.086,1.746±0.092,人hFOG1.19和小鼠MC3T3-E1的miR-302b相对表达量分别为8.172±0.424,6.053±0.441。MG63、U2OS、143B、Sao2细胞中的miR-302b相对表达量分别低于人hFOG1.19和小鼠MC3T3-E1细胞中的表达量,差异均有统计学意义(P<0.05)。miR-302b高表达组(n=16)与miR-302b低表达组(n=15)骨肉瘤患者在年龄、性别、发病部位方面差异无统计学意义。miR-302b低表达组86.7%(13/15)骨肉瘤患者发生转移率高于miR-302b高表达组56.3%(9/16),差异有统计学意义(P=0.035)。miR-302b低表达组骨肉瘤患者高级别病理级别占93.3%(14/15),高于miR-302b高表达组的50.0%(8/16),差异有统计学意义(P=0.02)。结论:miR-302b在骨肉瘤中低表达,且miR-302b与骨肉瘤病理级别和转移存在密切关联。第二部分细胞水平研究miR-302b调控骨肉瘤细胞增殖、凋亡、侵袭和转移的作用和机制目的:细胞水平研究miR-302b对骨肉瘤细胞增殖、侵袭和转移能力的调控作用及其靶向调控的分子机制。方法:瞬时转染miR-302b mimic分别上调骨肉瘤143B和MG63细胞的miR-302b,在转染miR-302b mimic后24、48、72、96h时间点,分别采用MTT检测细胞增殖能力;转染miR-302b mimic 48h后,采用Transwell法检测细胞侵袭能力,采用划痕实验检测细胞迁移能力;通过生物信息学分析软件程序预测潜在的靶基因,双荧光素酶报告系统验证miR-302b与靶基因的3’-UTR相互作用;探讨miR-302b对骨肉瘤143B和MG63细胞的Runx2 mRNA和蛋白表达水平的调控作用,探讨Runx2对下游基因的调控作用。qRT-PCR检测成骨细胞(hFOB1.19、MC3T3-E1)的OS细胞(MG-63,U2OS,143B,Saos2)中Runx2的表达水平,并检测31对骨肉瘤患者瘤体及瘤旁组织中Runx2 mRNA的相对表达量。设计Rescue实验,实验分为四组:miR-302b上调组(mimic+Runx2-ctrl),miR-302b上调+Runx2上调组(mimic+Runx2),Runx2上调组(mimic-NC+Runx2),对照组(mimic-NC+Runx2-ctrl),Transwell法检测细胞侵袭能力,采用划痕实验检测细胞迁移能力。结果:在骨肉瘤143B和MG63细胞中,miR-302b mimic转染组24、48、72、96h时间点的OD值分别低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05),miR-302b mimic转染组骨肉瘤细胞总凋亡率均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。在骨肉瘤143B和MG63细胞中,miR-302b mimic转染组骨肉瘤细胞跨膜细胞数目和细胞迁移率均低于对照组。miR-302b mimic转染组143B细胞的Runx2 mRNA及其蛋白表达量均低于对照组,miR-302b inhibitor转染组Runx2基因表达量高于对照组,差异分别有统计学意义。双荧光素酶报告基因实验结果表明,miR-302b转染显著抑制pmirGLO-Runx2-3’-UTR-wt的荧光素酶活性,但不影响携带突变体Runx2-3’-UTR的pmirGLO报告基因的荧光素酶活性。骨肉瘤细胞系中Runx2 mRNA的表达水平显着高于两种成骨细胞系,骨肉瘤患者瘤体组织中的Runx2 mRNA表达量高于瘤旁组织,差异有统计学意义。上调mir-302b可抑制RUNX2、OPN、MMP-2、MMP-9、MMP-13、MMP-14和VEGF的mRNA和蛋白表达水平,下调mir-302b可促进RUNX2、OPN、MMP-2、MMP-9、MMP-13、MMP-14和VEGF的mRNA和蛋白表达水平。miR-302b与Runx2共上调组的Runx2、OPN、MMP2、MMP9基因的蛋白和mRNA表达水平均高于miR-302b上调组,差异有统计学意义。结论:上调miR-302b可抑制骨肉瘤细胞增殖、侵袭和迁移以及促进其凋亡,miR-302b可能通过靶向Runx2调控骨肉瘤的侵袭转移。第三部分动物水平研究miR-302b调控骨肉瘤增殖和肺转移的作用目的:动物水平探讨miR-302b对骨肉瘤增殖和肺转移的作用。方法:建立胫骨原位骨肉瘤裸鼠模型,荷瘤成功后,在给药组(n=5)荷瘤裸鼠瘤体注射miR-302b agomir,以上调瘤体内miR-302b的表达,对照组(n=5)荷瘤裸鼠瘤体注射阴性对照物(miR-302b agomir-NC),监测两组小鼠肿瘤体积变化,给药结束后处死裸鼠并行X线检查原位肿瘤部位骨组织破坏情况,HE染色观察病灶组织坏死情况,检测肺部组织转移性结节数量。结果:miR-302b agomir给药组裸鼠胫骨肿瘤体积在给药后的7天、14天、21天、28天分别低于对照组,差异有统计学意义。肿瘤组织病理标本HE染色显示,miR-302b agomir给药组肿瘤坏死率高于对照组。小鼠X线检测结果表明,miR-302b agomir给药组胫骨骨破坏严重程度低于对照组。给药后28天处死裸鼠并取出肺组织,在显微镜下观察HE染色肺组织转移瘤病灶数目,结果表明,miR-302b agomir给药组肺组织转移瘤病灶数目明显少于对照组,差异有统计学意义结论:上调miR-302b可抑制裸鼠骨肉瘤的肿瘤生长及肺部转移。