鸡球虫病是由艾美耳球虫引起的一种危害极其严重的全球性寄生虫病,目前仍以药物防治为主。当前,抗药性仍是球虫病防治中遇到最严重的问题,其产生的机制尚不清楚。对控制某一特定药物耐药性基因的鉴定,可以监测耐药性的蔓延并增加指导用药策略的有效性；了解某一药物耐药性涉及哪些基因,可以帮助理解药物耐药性产生的分子基础,并促进新型药物的研发。本文以柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)抗地克珠利(Diclazuril)耐药株与马杜拉霉素(Maduramycin)耐药株为研究对象,经基因重组法选育获得对地克珠利与马杜拉霉素同时具有抗性的重组体,研究了不同耐药株之间的同工酶差异,并对耐药性相关基因进行了克隆与分析。1.基因重组法选育E. tenella抗地克珠利与马杜拉霉素耐药株将E. tenella地克珠利耐药株与马杜拉霉素耐药株等剂量(1×104个／只)同时感染无球虫鸡,把得到的杂交后代接种饲喂地克珠利与马杜拉霉素的鸡而获得抗两种药物的重组体,并对该重组体的部分生物学进行了研究。结果显示,该重组体的重组率为0.4%；重组体对地克珠利和马杜拉霉素的ACI均小于160,具有完全耐药性,对氯苯胍和尼卡巴嗪的ACI均大于180,具有完全敏感性；卵囊繁殖能力介于两个母株之间;致病性与母株无显著性差异。结果表明,用基因重组法首次成功筛选出了对地克珠利与马杜拉霉素同时具有抗性的E. tenella耐药株。为进一步筛选球虫抗药性相关基因奠定了基础。2. E. tenella不同耐药株的同工酶分析对E. tenella药物敏感株、地克珠利耐药株、马杜拉霉素耐药株以及两个耐药株重组体的LDH、GPI和G6PD三种同工酶进行了分析。结果显示,在LDH结果中,敏感株有一条浓带,三株耐药株均没有酶带；在GPI结果中,敏感株有4条带,地克珠利耐药株有GPI-2和GPI-4,而马杜拉霉素耐药株和重组体均含有GPI-2、GPI-3和GPI-4；在G6PD结果中,敏感株有4条带,而三株耐药株均只有G6PD-3和G6PD-4。同工酶分析表明,药物敏感株与三株耐药株之间的三种同工酶均有差异,三株耐药株之间的GPI存在差异,而在LDH和G6PD无差异。3.球虫耐药性相关基因的克隆与分析根据差异表达基因的ESTs序列,利用RACE技术,扩增获得了3个与耐药性相关新基因(M20、E2、H3)的全长cDNA,其中耐药株表达上调基因2个,下调基因1个。利用生物信息学分析软件对新基因编码蛋白的理化性质、信号肽、跨膜结构、疏水性、保守功能域及同源性等进行了分析预测。M20编码的蛋白分子量约为19 kDa,无跨膜结构,无信号肽,与刚地弓形虫(Toxoplasma gondii GT1)的胰岛素降解酶在31-477位氨基酸间具有45%的同源性；该基因在耐药株中表达上调,推测其通过降解胰岛素而阻碍胞外阳离子进入胞内,而使药物失效。E2编码的蛋白分子量约32 kDa,具有1个跨膜结构、1个信号肽和1个DUF477超家族蛋白保守功能域,与Toxoplasma gondii一种保守假定蛋白在31-285位氨基酸间具有36%的同源性；该基因在耐药株中表达下调,功能有待进一步研究。H3编码蛋白分子量约36 kDa,无跨膜结构,具有1个信号肽和1个层粘连蛋白G超家族保守功能域,与Toxoplasma gondii一种保守假定蛋白在10-340位氨基酸间具有65%的同源性；该基因在耐药株中表达上调,推测其促进虫体进入宿主细胞,减少高浓度药物对虫体的伤害,而使药物失效。综上,本文所采用的基因重组法为球虫表型的遗传学研究提供了重要思路,而对耐药性相关基因的克隆研究为从分子水平上阐明球虫耐药性产生机制提供了重要基础。