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铜绿假单胞菌的脂肪酸合成属于Ⅱ型脂肪酸合成体系,其中FabI是铜绿假单胞菌中最早被鉴定的烯脂酰ACP还原酶。研究显示敲除fabI基因,铜绿假单胞菌的生长速率和生长表型没有明显的影响,同时也不改变该菌对Triclosan的抗性。因此,推测铜绿假单胞菌中可能还存在一个对Triclosan抗性的烯脂酰ACP还原酶,然而这一观点始终没有得到证实。
本研究克隆了铜绿假单胞菌基因组中三个与肺炎球菌fabK类似的基因和一个与霍乱弧菌fabV同源的基因。互补大肠杆菌fabI温度敏感突变菌株JP1111,初步证明铜绿假单胞菌FabV是一种新的烯脂酰ACP还原酶,参与细菌脂肪酸合成代谢,而三个FabK的类似蛋白都没有这种还原酶活性。
在大肠杆菌中过量表达FabV蛋白,可以大幅度提高大肠杆菌对Triclosan的抵抗力;体外重组细菌脂肪酸合成反应也显示高浓度的Triclosan对FabV活性无影响。这表明铜绿假单胞菌FabV是一种具有Triclosan抗性的烯脂酰ACP还原酶。当fabV基因被插入失活之后,铜绿假单胞菌对Triclosan的抗性降低2000倍以上,这说明FabV的存在是导致铜绿假单胞菌对Triclosan有较高抵抗力的原因。
对酶活性特点的研究表明,铜绿假单胞菌FabV是一种NADH依赖的烯脂酰ACP还原酶,不能利用NADPH作为辅酶。虽然与FabI同属于SDR超家族,并且有相似的活性中心,但是FabV与FabI酶学特性有很大差异,FabV的最大反应速率是FabI的50-100倍,而对底物的亲和力是FabI的1/10左右。
fabI突变对铜绿假单胞菌的生长速率和生长表型没有明显的影响,而fabV的突变延长铜绿假单胞菌的生长代时。体外活力测定结果也显示,对不同链长的烯脂酰ACP,FabV的活力相当于FabI的十倍左右。同时突变株烯脂酰ACP还原酶残留活力测定表明fabV突变后,细胞抽提物仅残余30%烯脂酰ACP活性,而fabI突变可剩余60%的活性。这些数据都说FabV是铜绿假单胞菌中起主要的烯脂酰ACP还原酶。
磷脂中脂肪酸组分的分析表明,fabV突变和fabI突变都对脂肪酸组分有较大影响,尤其是fabI突变株中长链不饱和脂肪酸含量明显降低,而fabV突变后,长链的饱和和不饱和的长链脂肪酸含量都有明显增加。同时体外酶活性测定也表明FabI对长链脂肪酸有较高的活性。这些数据说明铜绿假单胞菌FabI在16碳脂肪酸延伸到十八碳的过程中有重要的作用。