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氯丙嗪是吩噻嗪药物中最典型的一种镇定剂,医学上被广泛应用于精神分裂症、狂抑郁症的治疗。兽医中氯丙嗪被用做镇静和止吐,降低动物维持需要,减少运输途中动物失重和死亡率。但是,欧洲药品管理局的文件指明氯丙嗪对人体具有白细胞减少、体位性低血压、肝功能障碍、皮炎和迟发性运动障碍等毒副作用。欧州早在1997年就颁布了禁止在饲料中添加氯丙嗪的禁令(EC)NO.17/97,我国发布的农业部第176、235号公告(2002年)也明确指出:严禁氯丙嗪在动物饲料和饮水中添加,在动物性食品中不得检出,但目前违规使用现象仍较普遍,发展可与仪器确证方法互补的快速检测技术,对于食品质量安全监测颇为重要。因此本研究以氯丙嗪为研究对象,开展酶联免疫吸附分析(ELISA)方法研究,获得了以下结果:
(1)氯丙嗪半抗原和全抗原的设计、合成和纯化根据氯丙嗪的化学结构特点,设计合成了2个具有吩噻嗪环的半抗原:2-氯-10-乙酸-吩噻嗪和2-氯-7-氨基-吩噻嗪,2个具有氯丙嗪完全结构特征的半抗原:7-氨基-氯丙嗪亚砜和7-(对羧基苯偶氮)-氯丙嗪,4个半抗原的连接位点和手臂长度、结构不同。使用活泼酯法和戊二醛法偶联蛋白制备了4种免疫原和包被原,通过质谱与核磁共振等波谱技术对半抗原进行鉴定,用紫外扫描和三硝基苯磺酸法对人工抗原进行鉴定,半抗原与人工抗原均成功合成。
(2)氯丙嗪多克隆抗体的制备及鉴定通过免疫新西兰大白兔制备了氯丙嗪的多克隆抗体,抗血清效价为64000,而用由2-氯吩噻嗪衍生的半抗原偶联蛋白免疫产生的抗体皆不能识别氯丙嗪,在交叉反应实验中,抗血清与氯丙嗪的结构和功能类似物无明显交叉反应,结果表明抗体特异性好,通过进一步分析可知氯丙嗪的N-(CH2)3-N(CH3)2侧链结构为氯丙嗪抗体识别的关键区域。
(3)氯丙嗪间接竞争ELISA法的建立与确证对包被原种类、包被浓度、包被温度和时间、药物稀释液、抗体稀释倍数、抗体稀释液、一抗二抗稀释液和竞争反应时间等ELISA条件进行优化,建立了氯丙嗪的最佳间接竞争ELISA检测方法,该方法的IC50为0.58ng/mL,检测限(IC10)为0.03ng/mL,标曲线性范围(IC20-IC80)为0.10~3.51ng/mL。建立了猪肉、鸡肉和猪肝样品中氯丙嗪的添加回收方法,采用乙腈2次震荡提取,正己烷去除脂肪法,各样品的添加回收率在77.1%~98.6%之间,变异系数小于10.2%。采用相同提取方法建立氯丙嗪的HPLC检测方法,两种检测方法相关系数R2=0.9929,表明建立的ELISA可靠准确,能应用于实际样品处理。
本研究利用设计合成的新的氯丙嗪半抗原,制备出高质量的氯丙嗪多克隆抗体,建立了应用于实际样品的间接竞争ELISA法,检测限在目前已知报道免疫检测法中最低,为商品化试剂盒的开发和进一步免疫检测研究打下基础。