论文部分内容阅读
失神经支配喉肌萎缩纤维化是导致神经修复后喉肌功能恢复不佳的重要原因，TGFβ1/Smad信号通路异常激活是诱导失神经支配骨骼肌萎缩纤维化的关键作用机制。近年来，miRNAs在机体生理病理进程中的重要调控机制日益受到关注。课题组前期研究证实，miR-21在失神经支配骨骼肌中表达上调，其在肝、肾、心肌等组织器官纤维化进程的重要作用已有文献报道。 目的： 研究miR-21通过调控TGFβ1/Smad信号通路对失神经支配骨骼肌萎缩纤维化的作用及机制。为减缓失神经支配骨骼肌萎缩纤维化提供可能的治疗靶点。 方法： 1.通过生物信息学分析筛选出20个可能参与调控TGFβ1/Smad信号通路关键基因的miRNAs，检测其在失神经支配骨骼肌中的表达水平。2.利用Targerscan、PicTar和miRanda等生物信息学分析软件对miR-21进行信息学分析，找到其TGFβ1/Smad信号通路上可能的作用靶点。采用双荧光素酶报告基因方法，分别将TGFβ1、TGFβR2、 Smad7和miR-21预测结合位点的序列装入报告基因载体pmiRGLO，再与人工合成的miR-21共转染小鼠成纤维细胞(NIH/3T3)，检测其相对荧光强度，并进一步用定量PCR及WB实验验证。3.采用重组TGFβ1诱导NIH/3T3细胞激活，通过miR-21抑制载体(Anti-miR-21)成功下调miR-21表达。定量PCR、免疫荧光等检测Smad7、p-Smad2/3、α-SMA等因子的表达。分别对NIH/3T3细胞转染miR-21 mimics和Anti-miR-21后流式细胞检测Smad7和p-Smad2/3的荧光强度，以及p-Smad2/3的核转位能力变化。4.建立坐骨神经损伤的动物模型，并构建了miR-21抑制载体(pLKO-Anti-miR-21)，转染至小鼠腓肠肌。术后2周处死动物并采集腓肠肌标本。采用免疫荧光、定量PCR等方法，检测miR-21、Smad7、TGFβ1以及致纤维化相关因子CTGF、α-SMA、collagen-Ⅰ的表达水平。 结果： 1.失神经支配骨骼肌中多个miRNAs的表达水平显著改变，其中包括miR-21。2.生物信息学分析结果提示miR-21可能的作用靶点是TGFβ1/Smad信号通路上的TGFβ1、TGFβR2和Smad7。双荧光素酶报告基因实验检测到Smad7组和TGFβR2组的相对荧光强度显著下降，提示其可能是miR-21的直接靶基因。定量PCR及WB实验也证实Smad7、TGFβR2是miR-21的直接靶基因。3.下调miR-21表达后定量PCR和免疫荧光结果提示:抑制miR-21可显著上调Smad7的表达，并下调p-Smad2/3的表达，TGFβ1/Smad下游关键致纤维化因子α-SMA表达亦明显下调。分别对NIH/3T3细胞转染miR-21 mimics和Anti-miR-21后流式细胞检测结果显示，miR-21 mimics组细胞内Smad7的荧光强度下降，p-Smad2/3的荧光强度上升;而Anti-miR-21组反之。核定位相似度及高定位细胞比率结果显示miR-21 mimics组细胞内p-Smad2/3的核转位能力增强，而Anti-miR-21组减弱。上述结果提示，成纤维细胞激活后，miR-21通过抑制Smad7的表达水平，诱导p-Smad2/3复合体的形成及转核，促进致纤维化因子α-SMA合成及分泌。4.动物实验结果显示:同对照组比较，miR-21抑制组Smad7的表达上调，而TGFβ1、CTGF、α-SMA和collagen-Ⅰ等下调。Masson染色发现，miR-21抑制组的腓肠肌萎缩纤维化程度小于对照组。抑制miR-21可减轻失神经支配诱导骨骼肌萎缩纤维化的程度。 结论： 本研究阐明了miR-21调控失神经支配骨骼肌纤维化的作用，其机制是miR-21通过抑制Smad7的表达水平，诱导p-Smad2/3复合体的形成及转核，促进致纤维化因子的合成及分泌。研究结果为减缓失神经支配骨骼肌萎缩纤维化，维持骨骼肌结构和功能的完整性，促进神经修复后骨骼肌的功能恢复，提供了有潜力的治疗策略。