背景与目的：　　 珠蛋白生成障碍性贫血是先天性的珠蛋白合成数量的减少导致的一组疾病，一般发生于温带地区。在β-珠蛋白生成障碍性贫血中，缺失的珠蛋白基因编码的是成人血红蛋白(adult hemoglobin，HbA，α2：β2)，它的缺失导致相对过剩的α-肽链形成包涵体沉积于细胞膜上，引起红细胞变形能力下降，在脾脏内被大量破坏而引起溶血性贫血。严重时如纯合子或者复合杂合子病人在没有治疗的情况下会在出生后一年内死亡。重型β-珠蛋白生成障碍性贫血患者需要终生输血治疗以纠正贫血及抑制大量红细胞形成导致的骨骼变形。但是，输血治疗会加重铁负荷而导致一系列并发症，严重时是致命的。目前β-珠蛋白生成障碍性贫血的确切治愈方法只有骨髓移植，但是即使是配型合适的供者提供的骨髓移植仍然可能导致严重的移植后并发症。事实上，即使是在最好的移植单位中移植后病人的死亡率和发病率也在10％～20％。理论上珠蛋白基因治疗可以应用于每个病人。但是，基因治疗面临着一系列的生物学难题，包括：造血干细胞的分离和转导，有效、安全载体的设计，无毒的移植条件等等限制了其临床应用。　　 胎儿血红蛋白(fetal hemoglobin，HbF)是由两个α链和两个γ链组成的四聚体。妊娠期复制的γ珠蛋白基因在转录的β-珠蛋白基因簇中占主要部分，出生后，γ珠蛋白基因被成人β珠蛋白基因取代，这个过程被称为“胎儿转换”(fetalswitch)，其中的分子机制仍有待进一步探讨。而且，成人期γ珠蛋白基因表达沉默的程度随个体的不同而有差异。在非贫血的病人中，HbF在总血红蛋白中的比例小于1％，但是在镰状红细胞贫血和β-珠蛋白生成障碍性贫血病人中，高水平的γ珠蛋白基因表达可以部分补偿有缺陷的或受损的β珠蛋白基因生成，从而缓解临床症状。　　 γ珠蛋白基因诱导剂可激活红系细胞中已基本关闭的γ珠蛋白基因，合成的γ链与相对过剩的α链构成胎儿血红蛋白(fetal hemoglobin，HbF)，降低α链与非α链之间的不平衡，减轻α链包涵体所致的原位溶血，从而改善临床症状。1982年国外首次报告应用5-氮杂胞苷(5-azacytidine，5-AZAC)治疗β-珠蛋白生成障碍性贫血患者取得较好疗效之后，陆续发现了多种γ珠蛋白基因诱导剂，如羟基脲(hydroxyurea，HU)、促红细胞生成素(Erythropoietin，EPO)、阿糖胞苷(cytarabine)、长春新碱(vincristine)、曲古抑菌素A(trichostatin A，TSA)、丁酸盐(butyrate)、地西他滨(decitabine)等。但是，目前这些药物的临床应用也受到诸多因素的限制，被美国食品和药物管理局(Food and DrugAdministration，FDA)批准应用于临床的药物只有HU，但是仍有25％的病人对HU治疗没有反应。因此，急待开发更为安全有效的治疗β-珠蛋白生成障碍性贫血的新药。　　 黄芪为豆科植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的干燥根，其性甘、微温，入肺、脾经，具有补气升阳、固表止汗、托毒排脓、利水消肿、敛疮生肌等功能。其主要生物活性成分之一的黄芪多糖(Astragalus polysaccharides，APS)具有刺激造血的作用，可以提高红系集落形成单位(colony-forming unit-erythroid，CFU-E)和红系爆式集落形成单位(burst forming units-erythroid，BFU-E)的形成率，从而增加红细胞数量与血红蛋白量。课题组前期的研究结果证明APS可诱导K562细胞红系分化，本研究进一步探讨APS对K562细胞在mRNA和蛋白水平的作用。　　 本研究旨在探讨APS诱导γ珠蛋白基因表达和HbF合成的作用，实验以人红白血病细胞系K562细胞为模型，通过RT-PCR、Western blotting和联苯胺染色技术分析APS作用于K562细胞后γ珠蛋白基因表达和HbF合成的变化，研究结果将阐明APS对γ珠蛋白基因表达的作用，为APS的临床应用提供理论基础。　　 方法：　　 1.药物制备及细胞培养：用超声醇提水提法提取APS，苯酚-硫酸法定量后过滤备用。以K562细胞为体外模型，APS诱导的K562细胞为实验组，0.5mmol/L丁酸钠(Na-butyrate，NaB)诱导48h的K562细胞为阳性对照，K562亲本细胞为空白对照组。　　 2.采用RT-PCR技术分析APS诱导K562细胞后Aγ和Gγ珠蛋白基因mRNA表达。　　 2.1剂量效应：用150mg/L、300mg/L、450mg/L APS诱导K562细胞，48h分别提取总RNA检测Aγ和Gγ珠蛋白基因mRNA表达水平。　　 2.2时间效应：300mg/L APS诱导K562细胞，分别在3h、6h、12h、24h、36h、48h、60h、72h收集细胞提取总RNA检测Aγ和Gγ珠蛋白基因mRNA表达水平。　　 3.通过Western blotting技术检测APS诱导K562细胞后HbF合成。　　 3.1剂量效应：用150mg/L、300mg/L、450mg/L APS诱导K562细胞，48h分别提取总蛋白检测HbF水平。　　 3.2时间效应：300mg/L APS诱导K562细胞，分别在3h、6h、12h、24h、36h、48h、60h、72h收集细胞提取总蛋白检测HbF水平。　　 4.采用联苯胺染色定性技术分析APS诱导K562细胞红系分化的作用。　　 5.采用锥虫蓝据染实验细胞计数法分析APS对K562细胞增殖的影响。　　 6.统计学方法：实验数据均以均数±标准差(X±S)表示，使用SPSS13.0 forWindows软件包进行单向方差分析(One-Way ANOVA)或重复测量数据的方差分析(Repeated Measure)。多重比较采用LSD(Least-significant-Difference)检验。P<0.05表示差异有显著性。　　 结果：　　 1 TT-PCR分析Aγ-珠蛋白和Gγ-珠蛋白mRNA表达水平。　　 1.1剂量效应：150 mg/L、300mg/L、450mg/L的APS诱导K562细胞Aγ-珠蛋白mRNA表达分别为空白对照组的2.45±0.25倍、3.59±0.16倍和3.08±0.19倍(F=117.673，P=0.000)，Gγ-珠蛋白mRNA表达分别为空白对照组的2.55±0.21倍、5.02±0.81倍和3.79±0.58倍(F=34.272，P=0.000)，诱导前后差异有显著性意义，APS诱导之后Aγ-和Gγ-珠蛋白mRNA表达均增强；与其他组相比，300mg/LAPS组诱导之后Aγ-和Gγ-珠蛋白mRNA表达有显著性差异(P<0.05)。　　 1.2时间效应：与空白对照组相比，300mg/LAPS诱导K562细胞后Aγ-(F=66.887，P=0.000)和Gγ-珠蛋白(F=227.782，P=0.000)mRNA表达水平在6h开始上升，48h～60h达峰值，300mg/L APS诱导后48h Aγ-和Gγ-珠蛋白mRNA表达量分别为空白对照组的2.54±0.19倍和4.21±0.14倍，以后开始下降，APS诱导前后差异有显著性意义；NaB诱导后48h Aγ-和Gγ-珠蛋白mRNA表达水平分别为未加药组的2.73±0.10倍4.86±0.22和(P=0.000)，诱导前后差异有显著性意义。与NaB组相比，300mg/LAPS诱导后48h Aγ-珠蛋白mRNA表达量差异无显著性意义(P=0.095)，Gγ-珠蛋白mRNA表达量差异有显著性意义(P=0.000)。　　 2 Westernblotting分析HbF表达水平2.1剂量效应：150 mg/L、300mg/L和450mg/L APS分别诱导K562细胞48h，HbF合成增强(F=310.476，P=0.000)，分别增加至未加药组的1.56±0.03、1.78±0.04和1.51±0.32倍，诱导前后差别有显著性意义。300mg/LAPS组与其他组相比HbF合成差异均有显著意义(P≤0.005)，可认为300mg/L APS对HbF合成诱导作用最强。　　 2.2时间效应：300mg/L APS诱导K562细胞后HbF合成逐渐增加，峰值在48h～60h，为未加药组的2.10±0.19倍(图4，F=27.259，P=0.000)，以后逐渐下降。与NaB组(2.88±0.27倍)相比，APS诱导K562细胞HbF合成差异有显著性意义(P=0.000)。　　 3联苯胺染色分析APS对K562细胞红系分化的作用150mg/L、300mg/L和450mg/L APS组诱导48h的BZ％值分别为13.57％±1.80％，15.67％±1:1.80％和10.80％±1.15％(F=5.154，P=0.000)，与未加药组4.37％±0.58％相比差异有显著性意义(P<0.05)，与NaB组(19.53％±4.00％)相比差异有显著性意义(P<0.05)。上述各处理组联苯胺染色阳性细胞总数不同(图2B，F=23.880，P=0.000)，120h内各组联苯胺染色阳性细胞总数均随时间推移而增多，150mg/L、300mg/L和450mg/LAPS组诱导K562细胞48h的联苯胺染色阳性细胞总数分别为(60.75±4.79)×102，(60.40±6.33)×102和(43.18±6.10)×102，与未加药组(20.35±2.98)×102相比差异有显著性意义(P<0.05)，与NaB组(42.02±16.42)×102相比差异有显著性意义(P<0.05)。　　 4 APS对K562细胞增殖的抑制作用不同浓度(150 mg/L、300mg/L和450mg/L)APS和0.5mmol/LNaB对K562细胞生长的影响不同(F=297.078，P=0.000)。APS的抑制作用随浓度升高而增强，但均弱于NaB(P<0.001)。APS和NaB各诱导K562细胞48h抑制率分别为20.45％和79.55％，差异有显著性意义(P=0.000)；诱导72h抑制率分别为38.46％和90.11％，差异有显著性意义(P=0.000)。　　 结论：　　 1.首次实验证明APS可以诱导K562细胞γ珠蛋白基因mRNA表达增强，且存在剂量效应和时间效应：150～450mg/L APS均可诱导K562细胞mRNA表达和HbF合成增强，300mg/L为最佳诱导浓度；mRNA水平和HbF水平在6h开始上升，48～60h达峰值，以后开始下降。　　 2.研究结果为阐明APS诱导γ珠蛋白基因表达提供新的科学依据，为APS的临床应用提供理论基础。