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D-甘露糖是一种功能性糖,具有诸多有益生理功效如益生元功能、降血压等,已被广泛应用于食品、药品、化妆品等行业。传统的提取法和化学法在制备D-甘露糖的过程中会加入大量的有机试剂且对反应条件的要求十分严格,因此,利用生物法制备D-甘露糖成为最近的研究热点,其中研究较多的是通过D-来苏糖异构酶催化D-果糖转化为D-甘露糖。D-来苏糖异构酶（D-LIase）是一种醛酮糖异构酶,有较宽的底物谱,多用于催化D-来苏糖与D-木酮糖以及D-果糖与D-甘露糖之间的转化。本文通过基因挖掘技术来寻找全新的D-来苏糖异构酶,并利用分子改造技术对该酶进行酸性改造,研究了该酶的相关酶学性质以及酸性改造后的美拉德反应程度变化,成功得到了一个耐酸耐高温的D-来苏糖异构酶,使得过程中的美拉德反应程度明显降低。本论文发掘了一株来源于古生热变形菌（Thermoprotei archaeon）的D-LIase（Thar-D-LIase）。结果表明该酶的最适温度为80℃,最适p H为6.5,最适金属离子为0.5 mMNi2+,对金属离子具有明显的依赖性。该酶具有较好的温度稳定性,在70℃和80℃分别孵育48 h和33 h后仍能维持50%以上的相对酶活,同时测得该酶的Tm值为88.30℃,为目前所有D-LIase中最高,因此该酶的蛋白结构也具有较高的稳定性。在以D-果糖、D-甘露糖、D-来苏糖、L-核糖作为底物反应时,其米氏常数Km分别为:10.1、111.5、76.1、1,427.9 mM,催化效率kcat/Km分别为:14.4、25.2、45.4、19.6 mM-1min-1。同时研究了不同温度下该酶催化不同浓度D-果糖产D-甘露糖的能力,随着温度升高,达到平衡的时间更短,而底物浓度的增高也会产生底物抑制使平衡转化率降低。在80℃条件下,以25 g/L～100 g/L的D-果糖为底物,反应12 h后,D-甘露糖的转化率由23.9%降低至17.1%。由于酸性环境能很好地抑制美拉德反应,本课题通过对Thar-D-LIase进行同源建模,并结合理性设计,利用定点突变技术对其进行弱酸性分子改造,使其最适p H降低的同时提高其在酸性环境下的催化酶活。设计的突变体有:E8K、E9K、E19K、E28K、D37K、D42K、D81K、E82K、K83E、P105K、E119K、E165K、E179K、E182K、E82K/P105K、E82K/E165K和P105K/E165K。最终筛选出一株效果最优的双点突变体E82K/P105K,结果显示,它的最适p H由6.5降低至5.5,且在p H 5.5条件下的酶活较野生酶提高了3.4倍。其对D-果糖和D-甘露糖的动力学参数Km分别为78.77 mM和328.12 mM,kcat/Km分别为15.37 mM-1·min-1和48.92 mM-1·min-1。同时,在80℃和p H 5.5条件下,以80 g/L的D-果糖为底物时,10 h后D-果糖转化率达18%,高于野生酶（17%）。此外,突变体E82K/P105K在p H 5.5条件下的美拉德程度较p H 6.5条件下显著降低。因此,本课题的分子改造成功提高了Thar-D-LIase在酸性环境下的催化能力,同时降低了美拉德反应。