【摘 要】
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背景结直肠癌是一种在世界范围内严重危害人类健康的消化道恶性肿瘤之一,据世界卫生组织最新报道,结直肠癌发病率位居所有恶性肿瘤的第三位,致死率是第二位。人们首次发现EYA基因是在研究果蝇眼睛的发育过程中发现的。EYA为SIX1的共激活因子,SIX-EYA复合物在不同类型的肿瘤中高表达,包括卵巢癌、恶性周围神经鞘瘤、乳腺癌等。研究发现在人结直肠癌中SIX1表达异常上调,关于EYA1与结直肠癌的发生发展及
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背景结直肠癌是一种在世界范围内严重危害人类健康的消化道恶性肿瘤之一,据世界卫生组织最新报道,结直肠癌发病率位居所有恶性肿瘤的第三位,致死率是第二位。人们首次发现EYA基因是在研究果蝇眼睛的发育过程中发现的。EYA为SIX1的共激活因子,SIX-EYA复合物在不同类型的肿瘤中高表达,包括卵巢癌、恶性周围神经鞘瘤、乳腺癌等。研究发现在人结直肠癌中SIX1表达异常上调,关于EYA1与结直肠癌的发生发展及转移的关系尚不完全清楚。目的通过检测EYA1在正常结肠黏膜上皮细胞NCM460和结直肠癌细胞系（HCT8、HCT116、LoVo、SW480、RKO）中的表达情况,利用瞬时过表达EYA1的LoVo细胞和siRNA干扰的RKO细胞,深入探讨EYA1对结直肠癌细胞系增殖与迁移能力的影响。方法1.利用Oncomine网站（http://www.oncomine.org）分析TCGA（The Cancer Genome Atlas,TCGA）结直肠癌患者（n=337）的EYA1 mRNA表达水平。采用免疫组化（Immunohistochemistry,IHC）检测EYA1在结直肠癌组织中的表达水平。利用OncoLnc网站（http://www.oncolnc.org）分析EYA1表达水平与结直肠癌患者生存率的关系。2.利用Western blot和实时定量PCR（Real-time quantitative PCR,q RT-PCR）方法检测EYA1蛋白和mRNA在正常结肠黏膜上皮细胞NCM460和结直肠癌细胞系（HCT8、HCT116、LoVo、SW480、RKO）中的表达水平。3.构建pc DNA3.1（+）-EYA1过表达载体,利用脂质体Lipofectamine 2000转染EYA1低表达的LoVo细胞;利用公司合成的靶向EYA1基因的siRNA转染到EYA1高表达的RKO细胞,采用Western blot和qRT-PCR方法检测EYA1过表达和干扰后其蛋白和mRNA的表达情况。4.利用CCK-8和克隆形成实验分析EYA1对LoVo细胞和RKO细胞增殖的影响;通过划痕实验和Transwell迁移实验分析EYA1对LoVo细胞和RKO细胞迁移的影响。结果1.通过Oncomine网站（http://www.oncomine.org）分析TCGA结直肠癌患者（n=337）的EYA1 mRNA表达水平。结果显示:与癌旁正常结直肠组织相比,结直肠癌样本中EYA1 mRNA表达水平显著升高。通过免疫组化方法检测EYA1在结直肠癌组织中的表达水平,结果显示:结直肠癌组织样本中EYA1的表达高于其癌旁正常结直肠组织（P<0.05）。利用OncoLnc网站（http://www.oncolnc.org）分析EYA1表达与结直肠癌患者生存率的关系,结果显示:EYA1的表达水平与结直肠癌患者的生存期呈负相关（P<0.05）。2.通过Western blot和qRT-PCR实验,结果显示:EYA1在LoVo细胞中表达相对较低,在RKO细胞中表达相对较高,因此选择LoVo和RKO细胞做后续实验。3.通过Western blot和qRT-PCR实验,结果显示:与LoVo-Ctrl细胞相比较,LoVo-EYA1细胞中的蛋白和mRNA表达明显上调（P<0.05）;通过siRNA干扰,与RKO-Ctrl细胞相比,RKO-si EYA1细胞中的EYA1蛋白和mRNA表达水平明显下调（P<0.05）。4.通过CCK-8实验的分析,结果显示:瞬时过表达EYA1的LoVo-EYA1细胞的生长速度显著高于对照组（P<0.05）;相反,干扰EYA1的RKO-si EYA1细胞的生长速度显著低于对照组（P<0.05）。克隆形成实验的分析结果得出:与LoVo-Ctrl相比,LoVo-EYA1组形成的克隆数明显增多（P<0.05）;RKO-si EYA1组形成的克隆数明显少于RKO-Ctrl组（P<0.05）。5.划痕实验的结果显示:EYA1过表达的LoVo-EYA1细胞的迁移速度明显比对照组快（P<0.05）;相反,EYA1干扰后的RKO-si EYA1细胞的迁移速度明显比对照组缓慢（P<0.05）。Transwell迁移实验结果显示:EYA1过表达的LoVo-EYA1细胞穿过的数量明显比对照组增多（P<0.05）;相反,EYA1干扰后的RKO-si EYA1细胞穿过的数量明显比对照组减少（P<0.05）。结论1.结直肠癌组织中EYA1的表达水平显著高于相对应的癌旁正常组织;EYA1表达水平与结直肠癌患者的生存期呈负相关。2.过表达EYA1促进结直肠癌细胞的迁移和增殖能力;siRNA干扰EYA1后抑制结直肠癌细胞的迁移和增殖能力。
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