论文部分内容阅读
宫颈癌是威胁全世界女性健康的第四大常见恶性肿瘤。据2018年美国癌症协会发布，2018年约有57万的妇女被诊断为宫颈癌，同时约有31万的妇女因宫颈癌致死。同时，据美国癌症联合委员会统计，进展期宫颈癌患者的5年生存率低于40%。值得关注的是，许多发展中国家因经济、政策等因素的制约，宫颈癌筛查的普及程度有限，其宫颈癌的发生率和死亡率仍呈现上升趋势，许多患者首次诊断即为进展期宫颈癌。不幸的是，超过20%的进展期宫颈癌患者会由于肿瘤的复发和侵袭迁移、或对放化疗不敏感，而治疗失败。尽管与宫颈癌侵袭迁移相关的分子和机制研究已开展了数十年，我们至今仍未发现能有效运用到宫颈癌临床治疗和预测的分子靶标。因此，发现新的可用于精准治疗的靶点和预测宫颈癌侵袭转移的生物标记分子，仍是目前宫颈癌研究的重要方向。
在本研究中，我们通过对肿瘤芯片数据库——“Oncomine”的检索，发现Calponin3(CNN3)分子在宫颈癌中的mRNA表达量较正常宫颈组织升高。同时，通过RT-PCR技术对宫颈癌和癌旁组织cDNA进行检测，也发现CNN3的mRNA在癌组织中相对高表达。同时，通过Pubmed文献检索我们发现CNN3的现有研究资料有限，其主要功能研究集中在细胞的运动、融合、神经元的分化和滋养细胞的侵袭能力等方面，目前关于CNN3在癌症尤其是宫颈癌中的功能知之甚少。
在本研究中，我们首先通过细胞功能学研究，观察过表达和敲减CNN3对宫颈癌的增殖和迁移侵袭的影响；然后利用免疫缺陷小鼠皮下瘤和静脉移植瘤肺转移模型，进一步确定稳转sh-CNN3对SiHa细胞的皮下成瘤能力和静脉肺转移能力的抑制。在此基础上，我们采用RNA-seq技术筛选出SiHa细胞CNN3敲减与否的差异表达基因，结合RT-PCR、WesternBlot验证和文献检索，锁定RPLP1进行细胞功能学研究，以证实RPLP1参与CNN3调节对宫颈癌生物学行为的过程，并通过WesternBlot和免疫组化确定RPLP1在宫颈癌中高表达。最后，结合共聚焦成像技术、蛋白核质分离技术和双荧光素酶报告系统，以证明CNN3能够通过调控RPLP1的转录调节宫颈癌细胞的增殖和转移侵袭能力。我们的研究旨在为研发新的靶向药物和新的分子标记物提供实验依据。
第一部分CNN3对宫颈癌增殖和迁移侵袭能力的影响
目的：
证实CNN3对宫颈癌细胞体外增殖和迁移侵袭能力的影响，及SiHa细胞小鼠皮下成瘤能力和静脉移植瘤肺转移能力的影响。
方法：
检测宫颈癌和癌旁组织中CNN3的mRNA的表达差异。分别应用siRNA和质粒调控CNN3表达，结合CCK-8增殖实验、平板克隆形成实验检测宫颈癌细胞的增殖能力，Transwell迁移和侵袭实验检测迁移和侵袭能力。通过构建慢病毒稳转SiHa细胞株、小鼠皮下移植瘤模型和静脉移植瘤肺转移模型，观察移植瘤生长和转移的能力。
结果：
1．在7对宫颈癌和癌旁组织中，CNN3mRNA在宫颈癌组织中的表达高于对应的癌旁组织，差异具有显著性。
2．过表达CNN3后，SiHa和CaSki的增殖能力和迁移侵袭能力显著提高，而敲减CNN3后，SiHa和CaSki的增殖和迁移侵袭能力显著降低。
3．在皮下移植瘤模型中，sh-CNN3稳转SiHa细胞的成瘤能力较sh-NC组显著减弱。
4．在尾静脉移植瘤模型中，sh-CNN3稳转的SiHa细胞的肺转移能力较sh-NC组显著减弱。
结论：
1．CNN3在宫颈癌组织中呈高表达。
2．CNN3促进宫颈癌细胞的增殖、迁移侵袭和小鼠移植瘤的生长和转移，提示CNN3在宫颈癌中发挥促癌作用。
第二部分RPLP1参与CNN3调控宫颈癌细胞的增殖和迁移侵袭
目的：
确定参与CNN3调控宫颈癌细胞生物学行为的下游靶分子。
方法：
RNA-seq检测筛选、RT-PCR及Westernblot验证SiHa细胞CNN3敲减与否的差异表达基因，寻找可能参与CNN3调控宫颈癌细胞生物学行为的候选基因。CCK-8增殖实验、平板克隆形成实验、Transwell迁移和侵袭实验、及拯救试验确定候选基因参与CNN3调控宫颈癌细胞生物学行为的过程。最后，我们通过收集宫颈癌和癌旁组织样本，提取蛋白，通过Westernblot检测癌和癌旁组织中CNN3下游靶基因编码蛋白在宫颈癌和癌旁组织中的表达情况；并收集病理蜡块制作组织芯片，利用免疫组化技术检测下游分子在宫颈癌鳞状上皮和正常宫颈上皮的表达情况。
结果：
1．与亲本细胞相比，CNN3敲减后SiHa细胞中存在48个差异表达基因，其中包括28个下调基因，19个上调基因，其中RPLP1的变化趋势和变化程度最大，且最接近CNN3。
2.在SiHa和CaSki细胞中，RPLP1蛋白表达随着CNN3蛋白表达的改变发生同向变化，而CNN3的蛋白表达不随RPLP1表达改变而变化。
3.过表达RPLP1后，SiHa和CaSki的增殖能力和迁移侵袭能力显著提高；而敲减RPLP1后，SiHa和CaSki的增殖和迁移侵袭能力显著减弱。
4.在SiHa和CaSki细胞中，RPLP1蛋白表达恢复可部分甚至全部的逆转CNN3敲减所致的宫颈癌细胞增殖能力和迁移侵袭能力的抑制。
5.RPLP1蛋白在宫颈癌组织中的蛋白表达量高于对应的癌旁组织。
6.RPLP1在宫颈癌鳞状上皮中较正常宫颈上皮高表达。
结论：
1．RPLP1促进宫颈癌细胞的增殖和迁移侵袭能力，提示RPLP1在宫颈癌细胞中发挥与CNN3同样的促癌功能。
2．恢复表达RPLP1能逆转由CNN3敲减所致的宫颈癌细胞增殖和迁移侵袭能力的抑制，提示RPLP1参与CNN3调控宫颈癌细胞的增殖和迁移侵袭。
3．RPLP1蛋白在宫颈癌上皮中的表达较正常宫颈上皮上调。
第三部分CNN3在转录水平调控宫颈癌细胞RPLP1的表达
目的：
明确CNN3对RPLP1的调控方式。
方法：
利用免疫荧光技术结合共聚焦技术检测、蛋白核质分离技术检测CNN3在宫颈癌细胞的胞质蛋白和胞核蛋白的分布情况。通过双荧光素酶报告实验，明确CNN3蛋白是否能改变RPLP1启动子区域的转录活性。
结果：
1.在SiHa细胞核内存在少量的CNN3蛋白。
2.在SiHa和CaSki中上调CNN3的表达，可提高RPLP1启动子区域的转录活性。
3．CNN3蛋白能够结合到RPLP1的启动子区域。
结论：
1．CNN3蛋白在细胞核内微量存在。
2．CNN3可以通过结合到RPLP1的启动子区域影响RPLP1的转录活性，调控RPLP1的表达。
在本研究中，我们通过对肿瘤芯片数据库——“Oncomine”的检索，发现Calponin3(CNN3)分子在宫颈癌中的mRNA表达量较正常宫颈组织升高。同时，通过RT-PCR技术对宫颈癌和癌旁组织cDNA进行检测，也发现CNN3的mRNA在癌组织中相对高表达。同时，通过Pubmed文献检索我们发现CNN3的现有研究资料有限，其主要功能研究集中在细胞的运动、融合、神经元的分化和滋养细胞的侵袭能力等方面，目前关于CNN3在癌症尤其是宫颈癌中的功能知之甚少。
在本研究中，我们首先通过细胞功能学研究，观察过表达和敲减CNN3对宫颈癌的增殖和迁移侵袭的影响；然后利用免疫缺陷小鼠皮下瘤和静脉移植瘤肺转移模型，进一步确定稳转sh-CNN3对SiHa细胞的皮下成瘤能力和静脉肺转移能力的抑制。在此基础上，我们采用RNA-seq技术筛选出SiHa细胞CNN3敲减与否的差异表达基因，结合RT-PCR、WesternBlot验证和文献检索，锁定RPLP1进行细胞功能学研究，以证实RPLP1参与CNN3调节对宫颈癌生物学行为的过程，并通过WesternBlot和免疫组化确定RPLP1在宫颈癌中高表达。最后，结合共聚焦成像技术、蛋白核质分离技术和双荧光素酶报告系统，以证明CNN3能够通过调控RPLP1的转录调节宫颈癌细胞的增殖和转移侵袭能力。我们的研究旨在为研发新的靶向药物和新的分子标记物提供实验依据。
第一部分CNN3对宫颈癌增殖和迁移侵袭能力的影响
目的：
证实CNN3对宫颈癌细胞体外增殖和迁移侵袭能力的影响，及SiHa细胞小鼠皮下成瘤能力和静脉移植瘤肺转移能力的影响。
方法：
检测宫颈癌和癌旁组织中CNN3的mRNA的表达差异。分别应用siRNA和质粒调控CNN3表达，结合CCK-8增殖实验、平板克隆形成实验检测宫颈癌细胞的增殖能力，Transwell迁移和侵袭实验检测迁移和侵袭能力。通过构建慢病毒稳转SiHa细胞株、小鼠皮下移植瘤模型和静脉移植瘤肺转移模型，观察移植瘤生长和转移的能力。
结果：
1．在7对宫颈癌和癌旁组织中，CNN3mRNA在宫颈癌组织中的表达高于对应的癌旁组织，差异具有显著性。
2．过表达CNN3后，SiHa和CaSki的增殖能力和迁移侵袭能力显著提高，而敲减CNN3后，SiHa和CaSki的增殖和迁移侵袭能力显著降低。
3．在皮下移植瘤模型中，sh-CNN3稳转SiHa细胞的成瘤能力较sh-NC组显著减弱。
4．在尾静脉移植瘤模型中，sh-CNN3稳转的SiHa细胞的肺转移能力较sh-NC组显著减弱。
结论：
1．CNN3在宫颈癌组织中呈高表达。
2．CNN3促进宫颈癌细胞的增殖、迁移侵袭和小鼠移植瘤的生长和转移，提示CNN3在宫颈癌中发挥促癌作用。
第二部分RPLP1参与CNN3调控宫颈癌细胞的增殖和迁移侵袭
目的：
确定参与CNN3调控宫颈癌细胞生物学行为的下游靶分子。
方法：
RNA-seq检测筛选、RT-PCR及Westernblot验证SiHa细胞CNN3敲减与否的差异表达基因，寻找可能参与CNN3调控宫颈癌细胞生物学行为的候选基因。CCK-8增殖实验、平板克隆形成实验、Transwell迁移和侵袭实验、及拯救试验确定候选基因参与CNN3调控宫颈癌细胞生物学行为的过程。最后，我们通过收集宫颈癌和癌旁组织样本，提取蛋白，通过Westernblot检测癌和癌旁组织中CNN3下游靶基因编码蛋白在宫颈癌和癌旁组织中的表达情况；并收集病理蜡块制作组织芯片，利用免疫组化技术检测下游分子在宫颈癌鳞状上皮和正常宫颈上皮的表达情况。
结果：
1．与亲本细胞相比，CNN3敲减后SiHa细胞中存在48个差异表达基因，其中包括28个下调基因，19个上调基因，其中RPLP1的变化趋势和变化程度最大，且最接近CNN3。
2.在SiHa和CaSki细胞中，RPLP1蛋白表达随着CNN3蛋白表达的改变发生同向变化，而CNN3的蛋白表达不随RPLP1表达改变而变化。
3.过表达RPLP1后，SiHa和CaSki的增殖能力和迁移侵袭能力显著提高；而敲减RPLP1后，SiHa和CaSki的增殖和迁移侵袭能力显著减弱。
4.在SiHa和CaSki细胞中，RPLP1蛋白表达恢复可部分甚至全部的逆转CNN3敲减所致的宫颈癌细胞增殖能力和迁移侵袭能力的抑制。
5.RPLP1蛋白在宫颈癌组织中的蛋白表达量高于对应的癌旁组织。
6.RPLP1在宫颈癌鳞状上皮中较正常宫颈上皮高表达。
结论：
1．RPLP1促进宫颈癌细胞的增殖和迁移侵袭能力，提示RPLP1在宫颈癌细胞中发挥与CNN3同样的促癌功能。
2．恢复表达RPLP1能逆转由CNN3敲减所致的宫颈癌细胞增殖和迁移侵袭能力的抑制，提示RPLP1参与CNN3调控宫颈癌细胞的增殖和迁移侵袭。
3．RPLP1蛋白在宫颈癌上皮中的表达较正常宫颈上皮上调。
第三部分CNN3在转录水平调控宫颈癌细胞RPLP1的表达
目的：
明确CNN3对RPLP1的调控方式。
方法：
利用免疫荧光技术结合共聚焦技术检测、蛋白核质分离技术检测CNN3在宫颈癌细胞的胞质蛋白和胞核蛋白的分布情况。通过双荧光素酶报告实验，明确CNN3蛋白是否能改变RPLP1启动子区域的转录活性。
结果：
1.在SiHa细胞核内存在少量的CNN3蛋白。
2.在SiHa和CaSki中上调CNN3的表达，可提高RPLP1启动子区域的转录活性。
3．CNN3蛋白能够结合到RPLP1的启动子区域。
结论：
1．CNN3蛋白在细胞核内微量存在。
2．CNN3可以通过结合到RPLP1的启动子区域影响RPLP1的转录活性，调控RPLP1的表达。