亚油酸异构酶高产菌株选育及其酶学特性研究

来源 :合肥工业大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:zgxkz
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共轭亚油酸(ConjugatedLinoleicAcid,CLA)具有增强免疫调节、抗动脉粥样硬化、抑制癌症、减肥、抗氧化等生理功能。目前,CLA主要由化学合成法和生物合成法得到,而生物合成法因其反应条件温和,产物成分较单一,在食品医药领域展现出了良好的应用潜力。  本文以黄瓜泡菜、萝卜泡菜、豇豆泡菜等为原材料,结合气质联用仪检测方法,从中筛选出具有转化亚油酸为共轭亚油酸能力相对较高的菌株,并对其进行菌种鉴定。以CLA转化率为考察指标,优化了菌株产共轭亚油酸的发酵条件,并对亚油酸异构酶的分离纯化及其酶学特性进行了研究。主要结论如下:  (1)从泡菜环境中筛选出具有较高CLA转化能力的的菌株——PC-3菌株,其能转化LA为具有生物活性的c9,t11-CLA和t10,c12-CLA。结合气质联用仪检测方法,经形态学、生理生化试验及16SrDNA序列分析,鉴定PC-3菌株为植物乳杆菌亚种PC-3菌株,其16SrDNA基因序列长度为1460bp,序列提交到GenBank登记,登陆号为JX270774.1。  (2)采用单因素试验和响应面试验设计方法,结果表明植物乳杆菌亚种PC-3菌株发酵的主要影响因素是培养时间、接种量和LA添加量,其较佳的发酵条件:诱导培养基为MRS培养基、培养时间为43.0h、接种量为3.0%(v/v)、LA添加量为1.30‰(v/v)、乳糖:硫酸铵=3:2、乳化剂Tween-80添加量为2.0‰(w/v)。  (3)采用超声波与酶法相结合的细胞破碎方法。超声波破碎次数为80次(超声3s,间歇4s,功率400w),溶菌酶添加浓度为0.8%,菌悬液浓度为15%g/mL,碎菌液体积为4mL,NaCl浓度为0.1mol/L。硫酸铵分段沉淀的饱和度范围为20%~80%,超滤后进行葡聚糖凝胶G-100过滤层析,提高植物乳杆菌亚种PC-3菌株亚油酸异构酶的纯化倍数可达4.60。经不连续SDS-PAGE电泳,测得该酶的相对分子量为42.88kDa。该酶最适反应温度为35℃,最适反应pH值为4.0,其热稳定性较差,在低温弱酸性条件下易于保存。该酶的Km=13.95mmol/L,Vmax=9.03mmol/L·h。
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