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白细胞介素(IL)-33是2005年Schmitz等使用计算机序列分析、发现并鉴定的一种前炎症细胞因子。它的基因序列和结构与IL-1家族成员IL-1β和IL-18最为相似,属于IL-1家族的一个新成员,也被称为IL-1F11。IL-33 mRNA在小鼠胃、肺、脊髓、脑、皮肤等组织及静止树突状细胞、活化的巨噬细胞高表达,在人平滑肌细胞及支气管或小气道上皮细胞为组成性表达。IL-33与其受体ST2结合,活化核因子(NF)-κB和丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK),诱导辅助性T细胞(Th)2细胞因子的产生,在多种炎症与免疫过程中发挥重要作用。目前,关于IL-33功能的研究在国内外都尚处于发展阶段。本研究用分子生物学技术克隆小鼠IL-33基因,通过构建其真核及原核表达载体、原核表达系统表达IL-33蛋白及其兔抗多克隆抗体的制备,探讨小鼠IL-33蛋白在不同组织中的表达分布及IL-33在不同疾病动物模型中的作用,为进一步研究其功能奠定了基础。本文主要研究内容如下:一、根据GenBank中小鼠IL-33基因序列(No. AY905582)设计特异性引物,用逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)技术,克隆出IL-33基因的全长编码区。将其克隆入pcDNA3.1(+)载体,构建其真核表达载体pcDNA3.1(+)-mIL-33,之后将该表达载体转化入大肠杆菌TOP10中,经菌落PCR、酶切鉴定及序列测序,得知它与GenBank中的序列完全一致,为IL-33基因的表达研究奠定了基础。二、根据小鼠IL-33基因序列设计特异性引物,用PCR技术,克隆出IL-33成熟蛋白编码区,将其克隆入载体pET-44,构建原核表达载体pET-44-mIL-33,经测序鉴定其编码基因与GenBank中的序列一致。将该表达载体转化入大肠杆菌BL21(DE3)中获得表达菌株,然后在25°C用IPTG诱导,表达的融合蛋白以可溶性蛋白及包涵体形式存在。用镍离子亲和层析法纯化以可溶性形式存在的目的蛋白,经凝胶图像分析确定其纯度可高达95%以上。细胞增殖实验结果表明,重组IL-33蛋白具有抑制细胞增殖的活性,且其活性比标准品高。三、利用纯化的IL-33蛋白,免疫新西兰白兔,制备兔抗小鼠IL-33多克隆抗体, ELISA结果显示,该多克隆抗体效价高达1:32 000;Western blot结果显示,该多克隆抗体可以与小鼠IL-33蛋白特异性结合。免疫组织化学染色结果显示,小鼠IL-33蛋白分布于支气管上皮细胞及肝细胞的细胞质或细胞核中。四、在IL-33与类风湿关节炎关系的研究中发现,抗IL-33多克隆抗体可减轻关节炎体征及关节腔内炎症细胞的浸润。总之,IL-33基因的克隆、成熟蛋白的原核表达、多克隆抗体的制备及对IL-33与类风湿性关节炎等炎症与免疫性疾病关系的初步探讨,为进一步进行IL-33的理论研究及临床应用研究奠定了基础。