【摘 要】
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胡柚是原产于浙江省的特色水果品种,营养物质丰富,具有一定的药理作用。随着当代人群生活水平的不断提高,人们的自我保健意识逐渐增强,益生菌发酵果蔬汁满足了当代人对天然产品的追求,产品需求量日益上升。本论文应用2种乳酸菌植物乳杆菌L1(Lactobacillus plantarum L1,L1)和发酵乳杆菌L2(Lactobacillus fermentum L2,L2),制备单菌和混菌发酵胡柚汁,研究
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胡柚是原产于浙江省的特色水果品种,营养物质丰富,具有一定的药理作用。随着当代人群生活水平的不断提高,人们的自我保健意识逐渐增强,益生菌发酵果蔬汁满足了当代人对天然产品的追求,产品需求量日益上升。本论文应用2种乳酸菌植物乳杆菌L1(Lactobacillus plantarum L1,L1)和发酵乳杆菌L2(Lactobacillus fermentum L2,L2),制备单菌和混菌发酵胡柚汁,研究了胡柚黄酮和酚酸在发酵过程中的变化及其机制,得到了发酵胡柚汁中酚类物质转化途径;并进一步探讨影响酚类物质转化相关酶活的发酵因素,并在满足发酵果汁的要求条件下考察重要酶的变化规律;最后探究胡柚中发酵前后酚类物质在人结肠癌细胞(Caco-2)细胞中的吸收转运特性,以及对Caco-2细胞在氧化损伤及脂多糖(LPS)外界炎症刺激下的保护及作用机制。研究结果可揭示胡柚汁发酵过程中酚类物质的变化规律,以及对细胞损伤的调节作用,为功能性发酵胡柚汁产品的开发提供理论依据。主要内容及结果如下:1.胡柚中酚酸、黄酮类成分在发酵过程中的转化途径分析与未发酵胡柚汁相比,单一菌种和混合菌种发酵的胡柚汁中总酚和总黄酮的含量均显著增加,胡柚中单体黄酮、酚酸的种类和含量在发酵过程中发生了一定的变化。通过实时荧光定量PCR(RT-q PCR)法对果汁发酵过程中植物乳杆菌L1、发酵乳杆菌L2产生的酚类物质转化相关酶基因表达进行测定,其中β-葡萄糖苷酶(bgl)、酚酸脱羧酶(pad A)、羧酸酯酶(cbl)、对香豆酸脱羧酶(pdc)的相对基因表达量与对照组相比显著升高,由此得到胡柚中酚酸和黄酮类物质在发酵过程中的转化途径为:黄酮苷类物质芦丁、柚皮苷、橙皮苷在β-葡萄糖苷酶的作用下转化为对应的苷元类物质槲皮素、柚皮素和橙皮素,酯化型的酚酸绿原酸等在酯化酶的作用下转化为分子量更小的酚酸咖啡酸、对香豆酸等,共轭酚酸在阿魏酰酯酶的作用下生成小分子量的酚酸阿魏酸,而这些小分子量的酚酸在酚酸脱羧酶的作用下转化成对应的乙烯基衍生物。2.β-葡萄糖苷酶酶活影响的发酵因素分析研究不同发酵条件(时间、温度、p H、诱导因子、金属离子)对两种乳酸菌产生β-葡萄糖苷酶酶活性的影响,结果显示,植物乳杆菌L1和发酵乳杆菌L2产生β-葡萄糖苷酶的最佳条件分别为发酵时间16 h、温度37℃、初始p H5.5和5.0时酶活最高;芦丁是效果最好的诱导因子,金属离子Fe2+和Mn2+对酶活起到促进作用,而金属离子K+和Mg2+对酶活起到抑制作用。3.发酵前后胡柚汁中酚类物质在Caco-2细胞中的吸收转运机制利用高效液相色谱法测定发酵前后酚类物质在细胞中的摄取量和转运量,结果发现芦丁和橙皮苷在实验过程中未见吸收,二氢咖啡酸、柚皮苷、柚皮素和橙皮素都属于中等吸收物质,二氢咖啡酸、柚皮素和橙皮素的转运方式为载体介导转运,柚皮苷的转运方式为外排主动运输,并且以P-gp作为转运载体。4.发酵前后胡柚汁中酚类物质对Caco-2细胞氧化损伤的保护作用建立Caco-2氧化损伤模型,通过测定胞内活性氧、细胞存活率、总抗氧化性、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶、乳酸脱氢酶、丙二醛含量,发现发酵前后胡柚中的酚类物质均对细胞氧化损伤有保护作用,并且发酵后的酚类物质效果更好。5.发酵前后胡柚汁中酚类物质对Caco-2细胞炎症损伤的保护机制构建脂多糖(LPS)诱导细胞炎症模型,测定抗炎因子、促炎因子和肿瘤坏死因子等的基因表达量,结果表明炎症诱导细胞组分抗炎因子基因IL-4等表达量显著降低,促炎因子和肿瘤坏死因子IL-6、TLR4等基因表达量显著升高,而酚类物质处理组与其结果相反,具有显著性差异,并且发酵后胡柚汁中酚类物质的效果更为明显。最后用Western blot法探究TLR4/My D88信号通路中相关蛋白表达,结果显示发酵前后胡柚汁中的酚类物质可以通过抑制TLR4、My D88、NF-κB蛋白的表达从而对LPS诱导的细胞炎症起到调节作用。
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