中药注射剂是传统中医理论与现代制剂技术结合的产物,因其起效快、作用迅速等特点,在治疗多种疾病时,特别是急危重症中发挥了重要作用,在临床治疗中具有无可替代的地位。然而,随着中药注射剂的广泛应用,其引起的不良反应也引起了广泛的重视。《国家药品不良反应监测年度报告》近3年数据显示,按照药品给药途径统计,药品不良反应/事件报告中,静脉注射给药占比超过50%,而中药注射剂则在其中占有较大比重。因此,对已上市的中药注射剂进行安全性再评价极为重要。注射用益气复脉（冻干）是由中国著名古方“生脉散”演变而来的现代中药注射剂,始载于张元素所著的《医学启源》,由红参、麦冬及五味子三种药味组成,其中红参为君药,麦冬为佐药,五味子为臣药。注射用益气复脉（冻干）具有益气复脉,养阴生津的作用,临床上主要应用于冠心病劳累性心绞痛气阴两虚证及冠心病所致慢性左心功能不全Ⅱ、Ⅲ级气阴两虚证等心血管系统疾病及微循环障碍。注射用益气复脉（冻干）的药理作用主要为调节心功能,缓解心力衰竭,对心肌缺血/缺氧再灌注损伤具有较好的治疗作用。注射用益气复脉（冻干）的主要化学成分为三萜皂苷、甾体皂苷、木脂素以及糖类等。注射用益气复脉（冻干）虽然在上市前已经进行了安全性评价,但仍然有不良反应事件的报道,因此,本课题首先对注射用益气复脉（冻干）的安全性进行再评价。在进一步确定其安全性之后,继而对注射用益气复脉（冻干）及其活性成分改善多柔比星诱导的脏器损伤进行了研究。1.注射用益气复脉（冻干）安全性评价在本研究中,分别建立体外实验模型:豚鼠离体回肠收缩模型、致敏豚鼠的离体模型;体内实验模型:小鼠类致敏模型和豚鼠主动致敏模型对注射用益气复脉（冻干）进行安全性评价。豚鼠离体回肠模型:依次考察不同浓度的注射用益气复脉（冻干）对静息离体回肠,乙酰胆碱及组胺诱导的离体肠收缩的影响。豚鼠于实验前进行适应性喂养,选择健康状态良好的动物于实验前禁食12 h。待颈脱臼处死动物后,立即沿回盲交界处上行2 cm剪取20 cm左右回肠肠段,置于通入95%O₂和5%CO₂的混合气体0℃的Tyrode’s液中,并用Tyrode’s液冲洗,除去内容物后,剪成多段2 cm的肠段。将肠段悬挂于通气挂钩上并与张力换能器相连。向浴槽中加入10m L Tyrode’s液,通入95%O₂和5%CO₂的混合气体,调整前负荷1.5 g,于37℃平衡1 h,期间每隔20 min更换一次Tyrode’s液。记录静息离体肠收缩张力,加入注射用益气复脉（冻干）,依次获得累计浓度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.2、1.4、1.6 mg/m L）依次记录离体肠平滑肌收缩张力。随后,更换肠段,分别加入乙酰胆碱和组胺对静息离体回肠进行预孵育,然后依照相同的给药量,评价注射用益气复脉（冻干）对乙酰胆碱和组胺引起的豚鼠离体回肠收缩张力的变化的影响。致敏豚鼠离体回肠模型:在对正常豚鼠离体回肠收缩实验模型的研究基础上,评估注射用益气复脉（冻干）对卵白蛋白致敏的豚鼠离体回肠平滑肌的影响。首先,选取体重在175-225 g之间的健康豚鼠,向豚鼠的左右后肢各注射1%的卵蛋白（溶于生理盐水）0.4 m L并给予腹腔注射1 m L 1%的卵白蛋白溶液后,正常饲养3周后,取致敏豚鼠,处死,迅速剖出回肠,依照正常豚鼠离体实验模型建模。待离体肠收缩稳定后,分别加入空白溶剂、不同浓度的注射用益气复脉（冻干）进行孵育,5 min后加入0.2 m L 1 mg/m L卵白蛋白溶液,记录离体肠收缩张力的变化。小鼠类致敏模型:以雄性ICR小鼠（20±2）g作为研究对象,随机分为8组,每组10只,分为含0.4%伊文思蓝染色液（EB）的阴性对照组、阳性对照组、注射用益气复脉（冻干）低剂量组和注射用益气复脉（冻干）高剂量组;不含0.4%EB的阴性对照组、阳性对照组、注射用益气复脉（冻干）低剂量组和注射用益气复脉（冻干）高剂量组。阴性对照组分别尾静脉注射含0.4%EB的生理盐水和不含0.4%EB的生理盐水;阳性对照组尾静脉注射含0.4%EB的C48/80（2.5 mg/kg）和不含0.4%EB的C48/80（2.5 mg/kg）;给药体积为20 m L/kg。在给药后的30 min内,观察给予0.4%EB的受试小鼠的行为学变化和耳廓蓝染情况。根据每组出现的耳廓蓝染的小鼠只数计算反应率,并对耳廓蓝染面积进行评分,评分完毕后,将动物处死。沿耳根剪下双耳,拍照后剪碎,37℃条件下在甲酰胺溶液中避光浸泡48 h以萃取耳廓内渗出的EB染料。过滤除去组织碎片。在630 nm处测量吸光度。根据伊文思蓝标准曲线,计算伊文思蓝渗出量。此外,将接受不含0.4%EB的半数小鼠于给药后5 min眼内眦取血,处死,3000 r/min离心后取血清,用以检测血清中组胺的含量;其余小鼠于给药后30 min,经眼内眦静脉丛取血,按照同样方法收集血清,用ELISA试剂盒测定血清中的5-羟色胺含量。取血后,摘取各组小鼠的耳和肺组织,用4%多聚甲醛固定、脱水、包埋、切片,H&E染色,光学显微镜下观察各组耳和肺组织病理学改变。豚鼠主动致敏实验:以雄性健康豚鼠为研究对象,将豚鼠随机分为阴性对照组,卵白蛋白组,注射用益气复脉（冻干）低剂量组和注射用益气复脉（冻干）高剂量组。每组10只豚鼠。造模过程分为致敏和激发两个部分。致敏阶段:阴性对照组隔日每只每次腹腔注射1 m L生理盐水,卵蛋白组隔日每只每次腹腔注射0.1%卵白蛋白1 m L,给药组依照给药剂量隔日每只每次腹腔注射1 m L注射用益气复脉（冻干）,共致敏三次。激发:在首次注射后第14天对每组的1-5号豚鼠称重并足趾静脉注射供试品溶液进行激发,阴性对照组注射生理盐水,卵白蛋白组静脉注射0.1%卵白蛋白2 m L,给药组静脉注射相应剂量,观察静脉注射后30分钟内动物出现的症状;在首次注射后第21天对其余豚鼠称重并静脉注射供试品溶液进行激发,观察静脉注射后30分钟内动物出现的症状并进行评价。观察完毕,对豚鼠进行股动脉取血,3000 r/min离心收集血清,采用ELISA方法测定血清中组胺及丙氨酸转移酶含量;用5 m L生理盐水经气管缓慢灌注肺右组织,回抽3次,收集肺泡灌洗液。将灌洗液以3000 r/min离心15 min,留取上清液,-80℃保存备用,用ELISA方法测定灌洗液中组胺的含量。将未被灌洗的左肺及肝置于4%多聚甲醛中固定,石蜡包埋,切片,H&E染色,观察病理变化。结果表明,在正常豚鼠离体模型实验中,注射用益气复脉（冻干）能够降低离体回肠的收缩张力,对离体回肠的自主收缩呈现显著的剂量依赖性抑制作用;而在乙酰胆碱和组胺所引起的离体回肠收缩张力增加的情况下,随着注射用益气复脉（冻干）给药浓度的增加,对这两种刺激剂引起的离体肠平滑肌肌张力的升高呈现出明显的抑制作用。因此,证明注射用益气复脉（冻干）可能为胆碱能受体和组胺H₁受体拮抗剂,在一定程度上能够对机体产生的组胺发挥拮抗作用,产生一定的抗过敏效应。在致敏豚鼠离体模型实验中,不同浓度的注射用益气复脉（冻干）对卵蛋白致敏的豚鼠离体回肠的收缩具有一定的抑制作用。随着注射用益气复脉（冻干）浓度的增加,对卵蛋白引起的豚鼠离体回肠收缩张力的抑制率也明显增加,表明注射用益气复脉（冻干）对致敏豚鼠离体回肠收缩的抑制作用存在剂量依赖性。小鼠类致敏实验结果发现,与阳性对照C48/80组相比,注射用益气复脉（冻干）低剂量组动物的耳廓蓝染面积小于2,伊文思蓝渗出量低于50%,血清中组胺和5-羟色胺含量明显低于C48/80组,与此同时,耳组织和肺组织病理学检测结果也未发现明显的病理结构变化和炎症浸润;与之相比,在注射用益气复脉（冻干）高剂量组中,动物耳廓蓝染面积评分为弱阳性,染色剂渗出率在50%至150%之间,引起轻微的类过敏反应,而该组小鼠血清中组胺含量较空白对照组显著升高,肺组织呈现轻微的肺泡壁增厚并出现少量炎症浸润,耳廓组织结构较稀疏,有轻微的水肿现象。豚鼠主动致敏实验结果显示,阴性对照组14天组和21天组的豚鼠均无异常表现。卵蛋白致敏的豚鼠14天组表现出明显的呼吸急促,搔鼻,步态不稳,活动减少等症状,21天组则表现出明显的喘息,活动减少,步态不稳,四肢瘫软等症状。注射用益气复脉（冻干）低剂量、高剂量14天组均未出现明显的症状,21天组有1只出现搔鼻,竖毛等症状为弱阳性反应,但其他几只鼠均未出现相关症状。注射用益气复脉（冻干）组血清和肺泡灌洗液中组胺的含量均在正常范围内,组织H&E染色结果表明,注射用益气复脉（冻干）14天组和21天组的肺组织结构正常,少见弥漫性肺泡间隔充血,少量淋巴单核细胞浸润。未见其余病变。肝组织结构完整,细胞索排列整齐,以中央静脉为中心向四周呈放射状排列,肝小叶轮廓清晰,肝细胞呈多边形,细胞分界清,核圆而清晰,位于细胞中央,细胞质丰富。因此,注射用益气复脉（冻干）基本无严重的主动致敏情况。结果表明,使用高于正常临床剂量的注射用益气复脉（冻干）可能会引起轻度的类过敏反应,因此,在临床应用时,一定要按照使用说明规范使用剂量,尽量避免引起不良反应。2.注射用益气复脉（冻干）化学成分分析及改善多柔比星导致大鼠脏器损伤的机制研究在本研究中,首先对注射用益气复脉（冻干）的化学成分进行了分析。精确称量注射用益气复脉（冻干,1.30 g）溶于30%甲醇中,然后用C8固相萃取柱（SPE）预处理以除去杂质。首先,用甲醇（10 m L）活化SPE,然后用去离子水（10 m L）活化。其次,将样品溶液加入SPE中,洗脱速率为1 m L/min。依次用含有0.5 mol/L氢氧化钠（2 m L）的30%甲醇（5 m L）和100%甲醇（5 m L）洗脱。收集100%甲醇并用100%甲醇定容至5 m L。然后使用0.45μm的膜过滤溶液,保存在4°C条件下。采用HPLC-Q-TOF-MS方法,对注射用益气复脉（冻干）的主要成分进行鉴别分析,共鉴别出了12种主要活性成分。明确了注射用益气复脉的主要成分后,本研究以SD大鼠为研究对象,建立多柔比星所导致的心肝肾损伤模型。适应性饲养一周后,对全部大鼠进行超声心动检查,剔除先天性心功能不全大鼠。随后,将40只大鼠随机分为4组,每组10只,分别为空白组,多柔比星组,注射用益气复脉（冻干）组和注射用益气复脉（冻干）治疗组。造模周期12天,对照组连续给予腹腔注射生理盐水（0.4m L/kg）;多柔比星组在第4天、第8天和第12天给予腹腔注射多柔比星（5 mg/kg）,其余时间给予生理盐水;注射用益气复脉（冻干）组持续给予注射用益气复脉（冻干,0.481 g/kg）;多柔比星+注射用益气复脉（冻干）组则在连续腹腔注射注射用益气复脉（冻干,0.481 g/kg）的基础上,在第4天、第8天和第12天给予腹腔注射多柔比星（5 mg/kg）,在整个造模周期内对每只鼠的体重进行记录。在最后一次给药24小时后,完成超声心动检测,检测完成后进行股动脉采血并处死全部实验动物,对全部大鼠的心、肝、肾组织称重并计算脏器指数,完成记录后,将部分脏器组织冻存于-80℃条件下,其余部分则固定于4%多聚甲醛中,以备开展后续实验。通过对各组大鼠血清中LDH、CK-MB、AST及ALT水平进行检测,并对H&E染色组织病理分析后发现,注射用益气复脉（冻干）能够显著降低由多柔比星引起的心功能损伤指标含量的升高,减轻组织病变,改善心功能,减轻心力衰竭,升高心脏射血分数,对心脏起到较好的保护作用。同时通过对心组织中活性氧簇（ROS）表达的检测发现,注射用益气复脉（冻干）可显著降低ROS的表达,减少组织中MDA、NO和i NOS的含量,同时显著提升抗氧化物酶SOD、CAT、GSH及GSH-Px的活性,减轻多柔比星诱导的心脏氧化应激损伤。通过评估心组织中炎症因子水平及细胞中凋亡蛋白的表达,注射用益气复脉（冻干）能够较好的调节多柔比星所导致的炎症反应和细胞凋亡,从而实现减轻多柔比星引起的心毒性的目的。而在运用相同的检测方法评估注射用益气复脉（冻干）缓解多柔比星所致肝、肾毒性的研究中,我们发现注射用益气复脉（冻干）可显著改善大鼠的肝、肾功能,减少肝、肾组织中ROS含量,降低脂质过氧化物MDA的水平,同时提升抗氧化物酶SOD、CAT及GSH等的活性,从而减轻多柔比星引起的肝、肾组织氧化应激损伤。经过注射用益气复脉（冻干）的治疗后,相较于多柔比星组,大鼠肝、肾组织中炎症因子NF-κB,TNF-α等的水平显著降低,细胞中凋亡蛋白BAX、BAX/Bcl-2、Caspase-3和细胞色素C的水平也明显降低。本研究结果表明,注射用益气复脉（冻干）可通过抑制多柔比星诱导的脏器组织中氧化应激损伤、炎症反应和细胞内凋亡蛋白的调节,显著改善心、肝及肾功能,减轻组织损伤,从而起到脏器保护的作用。3.注射用益气复脉（冻干）主要活性成分:人参皂苷Rg₁、Rb₁和五味子醇甲通过调节TLRs先天免疫途径和ROS表达,改善多柔比星诱导的心、肝、肾毒性。前期研究表明,注射用益气复脉（冻干）可显著改善多柔比星诱导的心、肝、肾毒性,抑制多柔比星造成的细胞氧化应激损伤,减少组织炎症因子含量,降低细胞凋亡蛋白水平。通过HPLC-Q-TOF-MS检测并鉴定出注射用益气复脉（冻干）中的12种活性成分,其中人参皂苷Rg₁、Rb₁和五味子醇甲含量最高。研究表明,人参皂苷Rg₁,Rb₁和五味子醇甲具有抑制氧化应激,炎症和线粒体凋亡,减轻脑缺血的作用,此外,人参皂甙Rb₁也可通过抑制ROS和JNK信号通路对心脏保护作用有所影响。但尚未有明确的文献报道,人参皂苷Rg₁,Rb₁和五味子醇甲是否能够同时改善多柔比星所诱导的心、肝、肾毒性。因此,我们进一步探究了注射用益气复脉（冻干）中的活性成分人参皂苷Rg₁、Rb₁和五味子醇甲对多柔比星所致脏器毒性的改善作用。本研究以小鼠为研究对象,建立多柔比星所致的心、肝、肾损伤模型,以RT-q PCR评估各组小鼠心、肝、肾各组织中TLR2、TLR3和TLR4m RNA的表达水平,运用Western blot方法检测TLRs信号通路下游蛋白My D88、P38和TRIF-β的表达水平,采用ELISA试剂盒检测IL-6,IL-1β,TNF-α和NF-κB等相关炎症因子的表达,同时评估各组小鼠心、肝、肾组织中ROS的含量。结果表明,与对照组相比,多柔比星脏器损伤模型小鼠能够显著诱导TLR2和TLR4m RNA的表达,抑制TLR3介导的信号通路,导致模型小鼠心、肝、肾组织中炎症因子水平升高,刺激ROS的释放继而引起氧化应激损伤。与之相反,在人参皂苷Rg₁、Rb₁和五味子醇甲的治疗下,小鼠的脏器功能得到显著改善,并对TLRs信号通路及其下游蛋白的表达进行调节,从而降低炎症因子的含量,和心、肝、肾组织中ROS水平,减轻多柔比星诱导的氧化应激反应,有效预防多柔比星导致的心、肝、肾毒性,达到脏器保护目的。