类聚异戊二烯产物一类以焦磷酸异戊二烯酯聚合形成的聚合产物,类聚异戊二烯产物包括低聚产物和高聚产物,其都有很广泛的应用价值。低聚产物如角鲨烯作为保湿剂和润肤剂广泛用于化妆品中,并有多种促进健康的功能,包括抑制肿瘤,增强免疫力等作用。高聚产物如聚异戊二烯作为天然橡胶主要应用于制造轮胎、胶乳、胶鞋、胶带等。但目前两者在大量生产上都受到限制,因此开发类聚异戊二烯产物的合成生物方法具有重要的应用价值。本课题在合成生物学的基础上进行代谢工程的构建,主要是以大肠杆菌为宿主菌,构建甲羟戊酸途径(MVA pathway)的完整途径。通过微生物细胞来生产目标产物角鲨烯和聚异戊二烯。本课题主要工作:(1)甲羟戊酸菌株的优化。基于构建甲羟戊酸上游代谢途径pET28a-ES,将其酶切筛选后进行大肠杆菌为宿主菌的优化。首先对大肠杆菌宿主菌优化时选取了E.coli DH5α和E.coli BL21两种宿主菌进行比较优化,明确E.coli BL21对于甲羟戊酸代谢途径的适配性更好;然后发酵培养基选取了 LB培养基、M9培养基和X培养基三种培养基进行比较优化,经比较菌株在X培养基中发酵生长最佳。其中实验菌株BLES在X培养基中MVA的产量最高,达到1.25 g/L。最终选取BL21作为宿主菌并在X培养基中进行发酵。(2)构建角鲨烯的代谢途径。根据已优化的甲羟戊酸上游途径,构建下游途径来完善代谢通路,并对目标产物角鲨烯进行发酵检测产物。主要是以ERG12、ERG8、ERG19、IDI1、fds为基础通过同尾酶的拼接连接到pET-22b的载体质粒上,形成基本的下游途径,即重组质粒pET22b-X。再添加来源于耶氏解脂酵母的ERG9,用于合成角鲨烯,即重组质粒pET22b-XQ。将 pET28a-ES 和 pET22b-XQ 共同转化到E.coli BL21 感受态中,得到角鲨烯工程菌株BLESXQ。发酵培养,对产物进行检测。测得产物角鲨烯,说明构建的角鲨烯代谢途径是可行的,且菌株BLESXQ在X培养基中产量明显达到最大值16.12 mg/L,同时进一步证明构建的甲羟戊酸的基本上下游途径在大肠杆菌中是可行的。(3)构建聚异戊二烯代谢途径。在上面构建pET22b-X的重组质粒的基础上添加来源于拟南芥的CPT和巴西橡胶树的SRPP,以形成目标代谢途径。得到两套聚异戊二烯代谢途径pET22b-XC重组质粒和pET22b-XS重组质粒。将两组重组质粒分别和pET28a-ES共同转化到E.coli BL21感受态中,得到聚异戊二烯工程菌株BLESXC和BLESXS,在菌株发酵验证产物,随后测CPT酶的酶活,没有检测到酶活和聚异戊二烯。说明CPT和SRPP基因所表达的酶并没有对聚异戊二烯的产生起到单独的作用。推测可能植物来源的酶与宿主不适配,可能缺少某种辅因子。