基于嗅觉与视觉的昆虫宿主定位行为研究——以白纹伊蚊和假眼小绿叶蝉为例

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在昆虫宿主定位行为中,嗅觉与视觉究竟哪个更为重要至今尚无定论。本研究选择福建地区广泛分布、并且具有重大危害的白纹伊蚊(Aedes albopictus)和假眼小绿叶蝉(Empoasca vitis)为研究对象,以干扰害虫对宿主生物的定向通讯行为为研究思路,整合形态学、分子生物学和行为学方法试图揭示嗅觉和视觉在昆虫宿主定位行为中的作用。以期深入理解昆虫的宿主定位行为机制并为害虫防治提供新思路。研究结果如下:  (1)应用RACE技术获得白纹伊蚊嗅觉共受体基因(AalbOrco)全长编码序列。结构预测表明AalbOrco为七跨膜蛋白并且N端在胞内而C端在胞外。序列比对显示AalbOrco与其它双翅目昆虫的Orco具有很高的同源性,尤其是在C端。进化分析表明不同目昆虫Orco各聚为一类,双翅目下聚为五科,研究结果支持蚊虫为双翅目中最早独立进化的一支。荧光定量PCR(qRT-PCR)分析表明,胚胎中AalbOrco的表达量要明显高于幼虫(P=1.2×10-5),随着幼虫生长至化蛹,AalbOrco的表达量迅速增加,至成虫期时最高(雌性显著高于雄性,P=4.36×10-4);在成虫不同组织的分析中,AalbOrco主要表达于化学感受器官(触角、触须、喙);推测AalbOrco的这种表达模式可能与白纹伊蚊寻找宿主并成功定位有关。此外,雄性腹部AalbOrco的表达量要显著高于雌性腹部(P=0.008),而产卵器和交配器没有该基因的表达。扫描电镜(SEM)显示雌雄触角具有丰富的嗅觉感器(毛形感器、锥形感器)和机械感器(Bǒhm氏鬃毛、刺形感器);唇瓣上的味觉感器(毛形感器、T2感器)亦为丰富;雌雄触须上有较多的刺形感器,雌性具头状感器(嗅觉感器)、而雄性缺如。免疫荧光定位发现AalbOrco在触角中主要表达于嗅觉感器神经元(OSNs)胞体以及毛形感器树突上,但不表达于锥形感器。此外,在喙的部分神经元胞体以及唇瓣T2感器树突中也有表达,而在雄性触须中仅表达于极少部分神经元中。通过构建表达AalbOrco片段dsRNA的细菌连续饲喂中期幼虫,虽然对照组与处理组的化蛹率和羽化率无显著差异(P=0.355和0.412),但AalbOrco的表达量呈明显下降(55.7%)(P=0.01),也相应地降低了(44.7%)雌蚊对宿主的吸血反应(P=8.44×10-5)。  (2)重新描述了假眼小绿叶蝉的形态结构并克隆分析了核糖体DNA(rDNA)序列,为本次研究建立样本标准。SEM和石蜡切片观察发现该叶蝉复眼发达,属“明视型眼”;触角嗅觉感器类型单一、稀少;口器上的味觉感器十分丰富;无下颚须和下唇须。这些形态表明此害虫适应白天活动,嗅觉不发达而味觉发达。应用同源克隆策略和RACE技术获取了该叶蝉的3种视蛋白基因(EV_LWop、EV_UVop、EV_Bop)以及内参基因(β-actin)全长编码序列。结构及功能预测表明这3种视觉蛋白具7个跨膜域以及视黄醛结合位点和G蛋白偶联受体家族特征。进化分析显示EV_LWop、EV_UVop和EV_Bop分属昆虫长波、短波以及中波视蛋白支系,并且与黑尾叶蝉(Nephotettix cincticeps)的亲缘关系最近。反转录PCR(RT-PCR)分析表明EV_L Wop和EV_Bop主要表达于中期若虫至成虫阶段,EV_UVop主要表达于后期若虫至成虫阶段。qRT-PCR分析表明这3种视蛋白基因在复眼大量表达,其中,雄虫复眼EV_LWop的表达量约为雌虫3倍。免疫荧光显示EV_LWop和EV_Bop主要表达于复眼中域感杆束的近端和中段,而EV_UVop表达于复眼全域感杆束的近端和中段以及部分远端感杆束。综合视蛋白的这种表达模式可能与视觉密切相关。通过饲喂视蛋白基因dsRNA后,除dsEV_UVop组存活率与对照组差异显著外,其它处理组(dsEV_LWop和dsEV_Bop)与对照组相差不明显;qRT-PCR检测表明视蛋白基因的表达量明显下降,并呈现时间效应(第6d,EV_LWop、EV_UVop、EV_Bop分别下降77.3%、40.0%、70.0%)。宿主趋性行为测定表明,在短距离(~20 cm)和长距离(~50cm)条件下虫体对宿主颜色均表现出趋性,短距离宿主气味可吸引虫体、长距离下虫体不表现出对宿主气味的趋性;证实视觉在远距离宿主定位中起主要作用。视蛋白基因干扰后,dsE V_L Wop和dsE V_B op处理组对宿主颜色的趋性较对照组呈显著降低,分别下降67.6%和29.5%(P=0.001和0.049),而dsE V_UVop组无差异(P=0.833);结果提示长波视蛋白在宿主颜色选择中起决定性作用。
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