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第一部分MiR-27a通过调控Spry2影响胰腺癌细胞生长、克隆形成及运动迁移的研究目的MicroRNAs是一种可以调控编码基因表达的小RNA分子,参与肿瘤的发生发展。近年来的研究发现,miR-27a在多种类型恶性肿瘤中表达上调,被认为具有癌基因功能。人们也检测到胰腺癌中miR-27a存在上调表达,但是其在胰腺癌中的功能尚不清楚。本研究旨在探讨认识miR-27a在胰腺癌细胞中的作用及可能机制。方法1.应用能够特异性抑制miR-27a活性的microRNA inhibitor,抑制胰腺癌细胞中内源性miR-27a功能,观察抑制后胰腺癌细胞生物学行为的改变；2.应用microRNAs靶基因预测软件和双荧光素酶报告基因实验筛选鉴定miR-27a的功能靶基因；3.应用免疫组织化学和western blotting的方法初步探讨miR-27a调控胰腺癌细胞恶性生物学特性的可能机制。结果1.抑制miR-27a能够降低胰腺癌细胞PANC-1和MIA PaCa-2的生长、克隆形成以及运动迁移能力；2.Spry2基因的3’UTR携带有miR-27a直接结合位点,并且胰腺癌细胞中Spry2蛋白的表达水平受miR-27a调控；3.抑制miR-27a能够下调胰腺癌细胞中p-Erk1/2的水平。结论1.MiR-27a通过影响生长、克隆形成以及迁移运动能力在胰腺癌细胞的恶性表型中发挥癌基因功能；2.Spry2在胰腺癌中低表达,miR-27a可能通过影响Spry2蛋白,异常调控了胰腺癌细胞中的Ras/MAPK信号通路。第二部分通过靶向泛素化降解K-ras癌蛋白抑制胰腺癌细胞PANC-1生长的研究目的随着人们对“泛素-蛋白酶体途径”认识的不断深入,一种被称为“靶向泛素化降解蛋白质”的技术(又称“蛋白敲减”技术)孕育而生。该技术能够直接在蛋白水平对功能异常的蛋白质进行“敲减”,从而逆转肿瘤细胞恶性生物学特性,为治疗恶性肿瘤提供了新的策略。本研究尝试利用“靶向泛素化降解蛋白质”技术,构建能够在蛋白水平直接有效“敲减”K-ras癌蛋白的融合型泛素连接酶E3,并初步探讨其对胰腺癌细胞生物学行为的影响。方法1.通过分子克隆技术构建融合型泛素连接酶E3；2.应用western blotting技术筛选鉴定能够有效“敲减”胰腺癌细胞PANC-1中K-ras癌蛋白的融合型E3重组质粒；3.通过体内免疫共沉淀和泛素化实验鉴定融合型E3靶向作用于K-ras癌蛋白的泛素连接酶活性；4.应用体外细胞学实验初步评价融合型E3对PANC-1细胞生长的影响。结果1.融合型泛素连接酶“RC-U”能够有效在翻译后水平通过泛素-蛋白酶体途径“敲减”PANC-1细胞内源性K-ras癌蛋白；2.瞬时转染“RC-U”重组质粒能够减慢PANC-1细胞在体外的生长,同时下调Erk1/2的磷酸化水平。结论成功构建了能够靶向作用于K-ras癌蛋白的融合型泛素链接酶“RC-U”,并初步实现了对胰腺癌细胞PANC-1体外生长的抑制,为进一步探索“靶向泛素化降解蛋白质”技术在胰腺癌基因治疗中的应用奠定了一定的实验基础。