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骨关节炎(Osteoarthritis, OA)是老年退行性关节疾病,其主要的病理改变是软骨细胞的过度凋亡和细胞外基质的降解。在骨关节炎病理改变这一过程中,细胞因子起到了关键作用,不仅可以促进软骨细胞分泌降解酶,导致细胞外基质的失衡,而且加速软骨细胞的凋亡。其中,白介素-1在众多细胞因子中是最重要的降解因子。白介素-1通过MAPKs信号通路及核因子-K B对基质金属蛋白酶(MMPs)的异常调控是导致软骨基质降解的主要途径。目前已经证实在MAPK家族中参与OA发病的有JNK, p38激酶及ERK,其中ERK1/2主要是促进增殖,调控细胞的终末分化,而JNK和p38MAPK信号转导通路是参与炎症反应调控的重要信号。核因子-K B结合多种基因启动子或增强子上的特异位点,促使相关基因转录。其中最典型核因子-K B的是以p65和p50两个亚基组成二聚体形式存在。在OA中MAPKs信号通路及核因子-K B介导的基质金属蛋白酶是降解细胞外基质的关键酶,可以降解几乎所有的细胞外基质,其中MMP-1、MMP-3、MMP-13是加速OA发生发展的主要蛋白酶。因此,调节IL-1介导的MAPKs信号通路及核因子-K B的稳定,下调MMPs的产生,延缓OA的病理变化,将为防治OA提供新靶点。本课题在补肾活血法治疗OA的学术思想指导下,以国家自然科学基金为依托,以体外培养的人OA软骨细胞作为研究对象,采用牛膝健步颗粒含药血清干预,借助CCK-8法、western blotting等技术,检测IL-1β调节MAPKs信号通路及核因子-κB相关因子ERK, P-38、JNK, P-65,下游MMP-3.-13蛋白的表达状况,探索补肾活血法干预OA的病理机制,为药物治疗OA的研究提供一种新思路。实验一：人OA软骨细胞MAPKs/核因子-κB信号转导因子的的表达状况目的：以正常软骨细胞为对照,观察人OA软骨细胞中MAPKs及核因子-κB信号表达状况。方法：采用Western blot技术比较正常软骨细胞与OA软骨细胞MAPKs亚家族ERK, P38, JNK及核因子-K B p65转导因子表达情况。结果：OA软骨细胞MAPK信号转导因子ERK、P38、JNK、P65蛋白表达较正常软骨细胞明显增强,有显著性意义(P<0.05)结论：MAPKs信号通路及核因子-κB转导因子在OA软骨细胞中的显著表达,与OA发生发展密切相关。实验二:牛膝健步颗粒对人OA软骨细胞MAPKs及核因子-κB的影响目的：观察牛膝健步颗粒是否对OA软骨细胞MAPKs及核因子-K B信号转导因子具有调节作用。方法：将OA软骨细胞分成5组,分别为OA软骨细胞组、OA软骨细胞组+对照血清组、OA软骨细胞组+含药血清小剂量组、OA软骨细胞组+含药血清中剂量组、OA软骨细胞组+含药血清大剂量组,培养48h后,采用Western blot技术检测各组细胞IRK、P38、JNK、P65蛋白表达情况。结果：牛膝健步颗粒能够抑制ERK、P38、P65转导因子,且抑制P38转导因子呈现剂量依赖性关系(P<0.05)；牛膝健步颗粒对JNK信号表达具有促进作用,明显高于OA组(P<0.05)。结论：牛膝健步颗粒能够干预MAPK信号通路及核因子-κB的转导,对软骨具有保护作用。实验三：IL-1p对人骨关节炎软骨细胞MAPK及核因子-κB信号的影响目的：观察IL-1β诱导OA软骨细胞MAPK和核因子-K B信号表达的情况方法：采用CCK-8法测定不同浓度IL-1β(Ong/ml、1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml)抑制OA软骨细胞增殖情况。采用Western blot技术检测OA软骨细胞组和IL-1p组P38、JNK、P65、MMP-3、MMP-13蛋白表达情况。结果：1ng/ml-100ng/ml IL-1β呈时效-量效关系抑制OA软骨细胞增殖;且1Ong/ml IL-1β作用48h对OA软骨细胞生长抑制作用较平稳,为最佳浓度；1Ong/ml IL-1β诱导OA软骨细胞JNK、P38及P65、MMP-3、MMP-13蛋白表达明显增强,具有统计学意义(P<0.05)。结论：在1Ong/ml浓度下,IL-1p可以抑制OA软骨细胞的增殖,显著诱导MAPKs口核因子-KB信号通路表达,很好的模拟了OA病理环境,为最佳效应浓度。实验四：牛膝健步颗粒对IL-1p体外诱导人骨关节炎软骨细胞增殖的影响目的：观察牛膝健步颗粒对IL-1β诱导OA软骨细胞增殖的影响。方法：将OA软骨细胞随机分为6组,分别为OA软骨细胞组+胎牛血清；OA软骨细胞组+对照血清+10ng/mIIL-1β； OA软骨细胞组+含药血清小剂量+10ng/mlIL-1β；OA软骨细胞组+含药血清中剂量+10ng/mlIL一1β；OA软骨细胞组+含药血清大剂量+10ng/mlIL一1β；10nｇ/mlIL—lβ模型组+胎牛血清,根据分组情况培养细胞24h、48h、72h后,应用CCK-8法比较各组细胞增殖情况。结果：牛膝健步颗粒大、中、小组含药血清组对IL-1p诱导OA软骨细胞增殖作用与OA组相比在48h后没有明显的差异,较24h时10ng/mlIL一1β模型组显著升高。结论：牛膝健步颗粒可以促进OA软骨细胞增殖,这可能是保护软骨细胞的机制之一。实验五：牛膝健步颗粒对人骨关节炎软骨细胞IL-1β/MAPKs及核因子-κB／MMPs信号通路的影响目的：观察牛膝健步颗粒是否对OA软骨细胞IL一1β/MAPKs及核因子-KB/MMPs信号通路具有调节作用。方法：将软骨细胞分成OA软骨细胞组、OA软骨细胞组+对照血清组+10ng/mlIL-1p.OA软骨细胞组+含药血清小剂量组+10ng/mlIL-1β、OA软骨细胞组+含药血清中剂量组+10ng/mlIL.1β、OA软骨细胞组+含药血清大剂量组+10ng/mlIL-1β,根据分组情况培养细胞48h后,采用Western blot技术检测各组蛋白表达情况。结果：牛膝健步颗粒可以明显抑制IL-1诱导OA软骨细胞分泌MMP-13、P38、P65转导因子,并且随着浓度的增加效果明显(P<0.05)；但牛膝健步颗粒抑制OA软骨细胞分泌MMP-3作用较弱；对JNK表达具有促进作用。结论：牛膝健步颗粒可调节P38,P65蛋白表达,抑制MMP-13表达,进而保护软骨细胞,对延缓软骨细胞破坏有一定的意义。