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花生是主要油料作物之一，同时也是重要的经济作物。我国是世界上主要的花生生产国家，产量占到世界总产量的40%。花生油作为一种比较容易消化的食用油，在我国食用油中占到30%。植物中三酰基甘油（TAG）是最主要的脂类储存形式。二酰甘油酰基转移酶（DGAT）是TAG合成途径中的关键酶，催化脂酰基转移到二酰基甘油（DAG）sn-3位上，并在此过程中起到限速作用。研究表明，DGAT的活性与油脂的积累速率以及含油量是呈正相关。本实验室从‘鲁花14’中已经克隆得到两种类型的DGAT2，分别命名为AhDGAT2a和AhDGAT2b，并从基因水平上进行了相关的研究。本文着重从AhDGAT2蛋白的原核表达以及亚细胞定位两方面进行研究。由于从植物体内提取纯化蛋白比较困难，而且产量低，利用大肠杆菌表达目的基因获得大量可溶性蛋白是一个方便快捷的方法。通过原核表达获得AhDGAT2蛋白为抗体制备以及AhDGAT2功能研究提供了理论和实验依据。pET28a-AhDGAT2原核表达载体构建及表达：根据AhDGAT2基因的ORF和pET28a原核表达载体的酶切位点选用NcoI和XhoI作为插入位点，将去掉终止密码子的1002 bp的AhDGAT2的ORF插入到pET28a原核表达载体，使AhDGAT2的C-端加上6×His Tag。pET28a-AhDGAT2重组载体转化BL21(DE3)菌株，结果显示没有可溶性蛋白表达。尝试其他菌株BL21(DE3)pLysS和Transetta(DE3)，也未有可溶性蛋白表达。可能pET28a原核表达载体不适合AhDGAT2的表达。pET28a-AhDGAT2(que)原核表达载体构建及表达：跨膜结构域分析发现AhDGAT2存在两个跨膜区。AhDGAT2(que)选用NcoI和XhoI作为酶切位点插入pET28a构建pET28a-AhDGAT2(que)原核表达载体，转化BL21(DE3)感受态诱导表达。实验结果显示AhDGAT2(que)融合蛋白成功表达。AhDGAT2a(que)融合蛋白分子量约为33.78 kDa，AhDGAT2b(que)融合蛋白分子量约为33.82 kDa。从诱导温度和IPTG浓度两方面优化融合蛋白表达的条件，SDS-PAGE结果显示，融合蛋白多以包涵体的形式存在。用Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒从包涵体中纯化到融合蛋白。pGEX-4T-1-AhDGAT2原核表达载体的构建及表达：pGEX-4T-1原核表达载体带有一个26.97 kDa的GST标签蛋白。GST-AhDGAT2a融合蛋白分子量约为64.47 kDa，GST-AhDGAT2b融合蛋白分子量约为64.51 kDa。本实验中，以BamHI和XhoI为酶切位点将AhDGAT2的ORF插入pGEX-4T-1原核表达载体，分别转化BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、Transetta(DE3)菌株诱导表达。SDS-PAGE结果显示，融合蛋白在3种菌株中均表达。GST标签必需有活性才能与谷胱甘肽树脂结合。因此，在融合蛋白纯化前对蛋白表达条件进行优化是必需的。经不同温度和IPTG浓度诱导后发现仅30℃时，在上清液和沉淀中均存在融合蛋白。蛋白纯化结果显示，融合蛋白主要以包涵体形式存在。为了确定表达的AhDGAT2(que)和AhDGAT2蛋白在大肠杆菌中是否会起作用，我们对重组菌进行了脂肪酸含量的测定。结果显示，在BL21(DE3)中，重组菌的总脂肪酸含量均有所增加，但在Transetta(DE3)重组菌中，脂肪酸总含量却是降低的。而且在这两种重组菌中，饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸均没有各自的变化规律。AhDGAT2的亚细胞定位：我们构建了3种亚细胞定位载体pBSK-35S-AhDGAT2-EGFP，pBSK-35S-EGFP-AhDGAT2(que)，pBSK-35S-AhDGAT2-RFP。通过基因枪转化法使AhDGAT2a和AhDGAT2b在洋葱表皮细胞中瞬时表达，用激光共聚焦显微镜进行观察。结果显示，以EGFP作为报告基因时，这两种蛋白在细胞质、细胞膜与细胞核中均存在。用同样的方法转化AhDGAT2a(que)和AhDGAT2b(que)的EGFP亚细胞定位载体，显示同样的定位结果。以RFP作为报告基因的亚细胞定位结果显示，转化有AhDGAT2b的洋葱表皮细胞的细胞质中存在一些颗粒状的物质存在荧光信号，而在细胞核和细胞膜上没有发现红色荧光信号。