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绵羊是重要的畜种，它能够为我们提供羊肉、羊奶、羊皮和羊毛等多种产品。对于肉用绵羊，生长和繁殖是选育的主要目标。但是，与绵羊生长和产肉相关的遗传因素还没有完全确认。因此，研究调节控制生长和产肉性状的代谢通路和基因将为提高羊肉产量和质量提供新策略。瘦素-黑皮质素信号通路上的基因在体重调节和能量稳态中至关重要。该通路上的相关基因，尤其是黑皮质素4受体(MC4R)、信号转导和转录激活因子3(STAT3)和瘦蛋白(LEP)基因能够通过影响下丘脑的活动来调控摄食和能量消耗。
基于在人类和其它物种中的相关报道的启发，本研究认为很有必要确定瘦素-黑皮质素信号通路相关基因上的变异和这些变异对绵羊体尺和体脂性状的影响，特别是阐明这些基因的结构和功能以及它们在绵羊不同组织中的表达量、鉴定那些位于MC4R基因启动子区上对该基因的转录调控起到重要影响的变异。
在本研究中，我们选择了5个中国地方绵羊品种，总计551只绵羊作为样本。使用聚合酶链反应(PCR)直接测序方法检测了这些基因的变异。用一般线性模型(GLM)研究这些变异与各种体尺和体脂性状间的关联。我们收集了42只绵羊从出生到六月龄的七个组织(下丘脑，肾，肝，心脏，肺，半膜肌和最长肌)的样本，检测MC4R和STAT3mRNA的相对表达量。用免疫组织化学(IHC)技术检测了STAT3蛋白在不同组织中的定位和表达。此外，为了确认MC4R的最小近端启动子区，我们基于PGL-3载体构建了五个质粒，将其转染到HEK293和C2C12细胞中。根据双荧光素酶测定质粒片段的活性，确定MC4R基因的最小调控区。本研究获得以下结果：
(1)在第一个研究(第2章)中，我们筛选出14个瘦素-黑皮质素信号传导的相关基因(LEP，LEPR，TUB，NPY，AgRP，POMC，JAK，SH2B1，STAT3，MC4R，MC3R，MRAP2，SIM1和BDNF)作为可能与生长和肉质性状相关的候选基因。用多种生物信息学工具对这些候选基因的功能基因组学进行分析。根据来自于不同绵羊品种的重测序数据(n=71)检查每个基因的多态性。用LOSITAN软件检测正在受选择的基因位点。基因的通路富集(GO)分析表明，这些候选基因与多个生物学过程相关，如进食行为的调节，能量稳态和cAMP生物合成的正调节。这些独特的生物过程可调节体重、生长和脂肪沉积。在这14个基因中共检测到7226个单核苷酸突变(SNP)。Fst/He的检验结果发现MC4R、STAT3、SH2B1和TUB基因显著正选择状态。这项研究为更好地了解绵羊快速增重和肌肉高产胴体性状的生物学过程提供了新的视角。这些结果有助于提高羊肉的产量，改善羊肉的成分。
2)在第二项研究(第3章)中，我们检测了绵羊MC4R基因的外显子，3非翻译(3UTR)和启动子区域，以获得在5个品种的480头绵羊中的遗传变异。我们一共检测到14个SNP，包括编码区上的五个SNP(SNP1：g.9C>T，SNP2：g.12C>G，SNP3：g.93G>A，SNP4：g.519C>G，SNP5：g.682G>C)，3非编码区中的1个SNP(SNP6：g.1016G>A)和基因的启动子(5侧翼2000bp)中的8个SNP(-1131C>T;?1038G>A;?1036G>T;?1026G>A;?943G>T;-287G＞A；-206G＞A和-103C＞G)。基因型-表型的关联分析结果显示在非同义替换位点G.519C>G位点上，GG基因型个体的体重(BW)、提高(WH)、胸围(Hg)、体长(BL)、臀长(RL)和臀宽(RW)显著高于AA基因型个体。此外，基因型GG和AA之间的背膘厚度(BFT)也存在显着差异(p<0.05)。在g.682G>C位点，GG基因型的个体比CC基因型的个体具有更高的臀部高度(HR)和背膘厚度(p<0.05)。此外，启动子活性分析结果表明，最小的近端启动子区域位于第一个外显子上游的-1207/-880bp。实时定量PCR(RT-qPCR)数据显示，MC4RmRNA在性别和年龄之间存在差异表达。我们的结果表明，MC4R基因中的SNP，尤其是单倍型H1H2，可以用于绵羊的标记辅助选择。
(3)在研究3(第4章)中，我们对STAT3基因上的遗传变异进行了研究，并验证了它们对绵羊体尺和体脂性状的贡献。我们在该基因的内含子和外显子区域中检测到24个SNP。用定量实时聚合酶链反应(qRT-PCR)和免疫组织化学的方法(IHC)检测STAT3基因的表达。qRT-PCR和IHC结果均证明STAT3在所有被测试的组织中普遍表达，并且在肝脏表达量最高。此外，STAT3在不同年龄和性别之间均存在差异表达。在这项研究中，检测到四个新的非同义单核苷酸多态性位点(nsSNPs)。关联分析结果还表明，STAT3的非同义突变对绵羊体重和体尺有显著的影响(p<0.05)。这是首例表明STAT3基因标记与体重和绵羊脂肪相关性状之间存在关联的报告。
(4)在研究4(第5章)中，评估了LEP基因的遗传变异与绵羊生长和脂肪沉积性状间的关联。在该实验中，从71位绵羊个体的重测序数据中检测到11个存在非同义替换的SNP位点。是在5个不同的绵羊品种总共250个个体中对这些SNP位点进行筛选。关联分析的结果表明大多数非同义替换的SNP与绵羊的一种或多种生长和脂肪性状显著相关。值得注意的是，一个SNP位点(g.257 C/T)可以提升个体的生长性能，而TT碱基对与脂肪评分升高相关。此外，3个非同义替换的SNP位点(g.257C/T→T86M，g.292G/A→D98N，g.470C/A→P157Q)能够增加蛋白质的稳定性。以上结果表明，这些非同义替换的SNP可以使LEP蛋白在获得更广泛范围的有益突变的同时维持其固有结构的稳定，从而增加基因的进化能力。
在本研究中，我们的数据表明瘦素-黑皮质素信号通路相关基因，特别是在本文深入描述的三个基因(MC4R、STAT3和LEP)可以用作绵羊育种的基因标记，以选择理想的体重和体脂性状。然而，生长性状和胴体性状受多方面调控，还有很多其他的生物分子和神经回路参与其中，确定这些复杂系统在绵羊生理中的作用将变得越来越重要。此外，通过标记辅助和基因组选择鉴定出的基因应在绵羊育种工作中受到足够的重视。
基于在人类和其它物种中的相关报道的启发，本研究认为很有必要确定瘦素-黑皮质素信号通路相关基因上的变异和这些变异对绵羊体尺和体脂性状的影响，特别是阐明这些基因的结构和功能以及它们在绵羊不同组织中的表达量、鉴定那些位于MC4R基因启动子区上对该基因的转录调控起到重要影响的变异。
在本研究中，我们选择了5个中国地方绵羊品种，总计551只绵羊作为样本。使用聚合酶链反应(PCR)直接测序方法检测了这些基因的变异。用一般线性模型(GLM)研究这些变异与各种体尺和体脂性状间的关联。我们收集了42只绵羊从出生到六月龄的七个组织(下丘脑，肾，肝，心脏，肺，半膜肌和最长肌)的样本，检测MC4R和STAT3mRNA的相对表达量。用免疫组织化学(IHC)技术检测了STAT3蛋白在不同组织中的定位和表达。此外，为了确认MC4R的最小近端启动子区，我们基于PGL-3载体构建了五个质粒，将其转染到HEK293和C2C12细胞中。根据双荧光素酶测定质粒片段的活性，确定MC4R基因的最小调控区。本研究获得以下结果：
(1)在第一个研究(第2章)中，我们筛选出14个瘦素-黑皮质素信号传导的相关基因(LEP，LEPR，TUB，NPY，AgRP，POMC，JAK，SH2B1，STAT3，MC4R，MC3R，MRAP2，SIM1和BDNF)作为可能与生长和肉质性状相关的候选基因。用多种生物信息学工具对这些候选基因的功能基因组学进行分析。根据来自于不同绵羊品种的重测序数据(n=71)检查每个基因的多态性。用LOSITAN软件检测正在受选择的基因位点。基因的通路富集(GO)分析表明，这些候选基因与多个生物学过程相关，如进食行为的调节，能量稳态和cAMP生物合成的正调节。这些独特的生物过程可调节体重、生长和脂肪沉积。在这14个基因中共检测到7226个单核苷酸突变(SNP)。Fst/He的检验结果发现MC4R、STAT3、SH2B1和TUB基因显著正选择状态。这项研究为更好地了解绵羊快速增重和肌肉高产胴体性状的生物学过程提供了新的视角。这些结果有助于提高羊肉的产量，改善羊肉的成分。
2)在第二项研究(第3章)中，我们检测了绵羊MC4R基因的外显子，3非翻译(3UTR)和启动子区域，以获得在5个品种的480头绵羊中的遗传变异。我们一共检测到14个SNP，包括编码区上的五个SNP(SNP1：g.9C>T，SNP2：g.12C>G，SNP3：g.93G>A，SNP4：g.519C>G，SNP5：g.682G>C)，3非编码区中的1个SNP(SNP6：g.1016G>A)和基因的启动子(5侧翼2000bp)中的8个SNP(-1131C>T;?1038G>A;?1036G>T;?1026G>A;?943G>T;-287G＞A；-206G＞A和-103C＞G)。基因型-表型的关联分析结果显示在非同义替换位点G.519C>G位点上，GG基因型个体的体重(BW)、提高(WH)、胸围(Hg)、体长(BL)、臀长(RL)和臀宽(RW)显著高于AA基因型个体。此外，基因型GG和AA之间的背膘厚度(BFT)也存在显着差异(p<0.05)。在g.682G>C位点，GG基因型的个体比CC基因型的个体具有更高的臀部高度(HR)和背膘厚度(p<0.05)。此外，启动子活性分析结果表明，最小的近端启动子区域位于第一个外显子上游的-1207/-880bp。实时定量PCR(RT-qPCR)数据显示，MC4RmRNA在性别和年龄之间存在差异表达。我们的结果表明，MC4R基因中的SNP，尤其是单倍型H1H2，可以用于绵羊的标记辅助选择。
(3)在研究3(第4章)中，我们对STAT3基因上的遗传变异进行了研究，并验证了它们对绵羊体尺和体脂性状的贡献。我们在该基因的内含子和外显子区域中检测到24个SNP。用定量实时聚合酶链反应(qRT-PCR)和免疫组织化学的方法(IHC)检测STAT3基因的表达。qRT-PCR和IHC结果均证明STAT3在所有被测试的组织中普遍表达，并且在肝脏表达量最高。此外，STAT3在不同年龄和性别之间均存在差异表达。在这项研究中，检测到四个新的非同义单核苷酸多态性位点(nsSNPs)。关联分析结果还表明，STAT3的非同义突变对绵羊体重和体尺有显著的影响(p<0.05)。这是首例表明STAT3基因标记与体重和绵羊脂肪相关性状之间存在关联的报告。
(4)在研究4(第5章)中，评估了LEP基因的遗传变异与绵羊生长和脂肪沉积性状间的关联。在该实验中，从71位绵羊个体的重测序数据中检测到11个存在非同义替换的SNP位点。是在5个不同的绵羊品种总共250个个体中对这些SNP位点进行筛选。关联分析的结果表明大多数非同义替换的SNP与绵羊的一种或多种生长和脂肪性状显著相关。值得注意的是，一个SNP位点(g.257 C/T)可以提升个体的生长性能，而TT碱基对与脂肪评分升高相关。此外，3个非同义替换的SNP位点(g.257C/T→T86M，g.292G/A→D98N，g.470C/A→P157Q)能够增加蛋白质的稳定性。以上结果表明，这些非同义替换的SNP可以使LEP蛋白在获得更广泛范围的有益突变的同时维持其固有结构的稳定，从而增加基因的进化能力。
在本研究中，我们的数据表明瘦素-黑皮质素信号通路相关基因，特别是在本文深入描述的三个基因(MC4R、STAT3和LEP)可以用作绵羊育种的基因标记，以选择理想的体重和体脂性状。然而，生长性状和胴体性状受多方面调控，还有很多其他的生物分子和神经回路参与其中，确定这些复杂系统在绵羊生理中的作用将变得越来越重要。此外，通过标记辅助和基因组选择鉴定出的基因应在绵羊育种工作中受到足够的重视。