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降纤酶在国内临床上有广泛的应用,常用于急性心肌梗塞、脑血栓等血栓疾病的治疗,其去纤、抗凝、降脂、扩张血管和改善微循环等功能得到了充分的肯定,但是在使用过程中仍具有蛋白质药物所共有的缺点——免疫原性高、稳定性差、半衰期短。 蛋白质PEG修饰技术在过去的近15年中得到了快速发展,已有多篇文献报道了经PEG修饰的蛋白质药物降低了免疫原性、提高了稳定性、延长了半衰期,并用于临床治疗各种疾病。本论文工作希望通过对降纤酶的聚乙二醇化,获得低免疫原性、高稳定性的降纤酶,改善该蛋白酶的药代动力学以及给药便利程度。 在降纤酶的PEG修饰试验中,尝试了mPEG-ALD、mPEG-SPA、mPEG-SBA、mPEG2-NHS等多种PEG。结合酶活、修饰率及产物的纯度三个方面确定最佳的PEG——mPEG-SPA;通过正交试验确定最佳修饰条件,即反应缓冲液pH为6.5、降纤酶与PEG的摩尔比n为1:20、反应时间t为1h以及反应温度T为37℃。当PEG修饰在此最佳修饰条件下进行时,可以在保持降纤酶较高酶活的基础上得到最高的修饰率;在四个影响因素中,反应摩尔比对降纤酶的PEG修饰影响最显著,级差为O.191;影响最小者为反应时间,级差仅为0.045:建立了以HPLC、superdex75、SDS-PAGE等方法为主的降纤酶及其修饰产物的分离纯化、检测方法,利用分子筛柱层析得到了酶活性有较高保留的两种单一修饰产物Df-mPEG-SPA5000,Df-mPEG-SPA30000;在最佳修饰条件下,mPEG-SPA5000对降纤酶的修饰率为46.7%,降纤酶回收率为45.2%。mPEG-SPA30000对降纤酶的修饰率为38.2%,降纤酶回收率34.1%。 进行了降纤酶及其聚乙二醇单一修饰产物的性质研究,结果显示降纤酶的聚乙二醇化修饰达到预期研究目标。Df-mPEG-SPA5000酶活保持率达42.3%,Df-mPEG-SPA30000的酶活保持率为37.9%。Df-mPEG-SPA5000、Df-mPEG-SPA30000的免疫原性降低;Df-mPEG-SPA5000的稳定性提高、降纤作用时间延长。进行了修饰位点确认工作的初步研究,为进一步确认修饰位点奠定基础。 本研究工作主要内容已经申请国家发明专利,专利申请号:200410017779.4。