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人类癌基因启动子区G-四链体DNA基因转录复制过程中起至关重要的作用,已成为基因组学、临床医学和药物设计研究的靶点。近年来,围绕分析G-四链体结构及其特异性识别的实验技术和方法发展迅速。由于G-四链体结构动态易变的特点,现有的表面等离子共振荧光能量共振转移和分子信标等方法都需要标记DNA,可能会影响G-四链体结构的形成。同时,考虑到生命体内的互补序列,通过杂交形成的DNA双螺旋与G-四链体、i-motif间存在平衡。因此,设计并建立一种能高效辨别不同结构DNA,并能够准确分析DNA分子识别的特异性作用机理的分析手段就显得至关重要。基于以上研究思路,本课题的具体研究内容如下:1.选取了人类C-myb原癌基因转录起始位点第17对碱基下游的一段富G序列S1。首先,利用电喷雾质谱(ESI-MS)快速筛选出对S1 G-四链体DNA有明显亲合力的4中天然产物分子(白杨素、澳洲茄碱、澳洲茄边碱和澳洲茄胺)。进一步通过紫外光谱和圆二色谱法定量分析G-四链体DNA与天然产物分子的相互作用,得到结合常数大小顺序依次为:澳洲茄胺>白杨素>澳洲茄碱≈澳洲茄边碱;CD升温实验的结果发现,亲合力越大的生物碱类分子越能够促进G-四链体DNA结构的稳定,而黄酮类分子白杨素的结合则不利于G-四链体结构的稳定。最后通过荧光竞争实验表明这4种天然产物分子可能与S1序列G-四链体DNA侧面的沟区或表面结合。2.建立毛细管电泳(CE)准确分析相互作用的方法,以环糊精与萘衍生物分子间的相互作用作为模型进行定量分析,并进一步结合理论计算对该方法进行测评。选定的一系列萘衍生物在不同的位置具有亲水性的磺酸盐和羧酸盐,建立基于粘度校正的亲和毛细管电泳法,准确分析环糊精与萘衍生物分子间的相互作用,获得结合常数。进一步利用分子模拟软件计算出二者结合过程的相对能量,与亲和毛细管电泳法的结果进行比较,证明了亲和毛细管电泳在测定相互作用中的准确性。3.建立ESI-MS与毛细管电泳前沿分析法(CE-FA)相结合的组合分析法,用于C-myb癌基因G-四链体DNA与生物碱类天然产物间的相互作用。首先,利用ESI-MS快速筛选出3种有亲合力的生物碱类天然产物,亲合力顺序依次为:土荆皮乙酸>丁溴东莨菪碱>荷叶碱。接着建立CE-FA法进一步分析溶液中G-四链体DNA与生物碱分子结合的特异性。结果表明,ESI-MS筛选的土荆皮乙酸在CE-FA中并未显示有结合。分析原因可能是由于在CE-FA中,土荆皮乙酸与G-四链体均带负电荷而相排斥;在ESI-MS的电喷雾离子化过程中,带负电荷的土荆皮乙酸提高了 DNA的离子化效率,导致ESI-MS假阳性结果。此外,荷叶碱属于非特异性结合,而丁溴东莨菪碱属于特异性结合,结合比为1:1,结合常数为1.18×105M-1。