论文部分内容阅读
目的探讨BRF1(butyrate response factor1)对炎性状态下的RAW264.7小鼠巨噬细胞中炎性因子的影响,以及BRF1影响巨噬细胞炎性因子的表达可能存在的机制。同时探讨BRF1在小鼠免疫性炎症疾病中发挥的功能。为进一步研究BRF1在炎症代谢中发挥生物学功能提供实验基础和理论依据。方法应用Ad-Easy腺病毒包装系统构建和包装过表达和干扰腺病毒Ad-BRF1/Ad-siBRF1,运用蛋白免疫印迹及荧光定量PCR检测该基因在细胞中蛋白及RNA表达情况,并检测过表达BRF1对巨噬细胞自噬以及凋亡的影响。应用LPS(Lipopolysaccharide)、肿瘤坏死因子a(TNFa)、白介素1β(IL1β)构建炎症模型,检测和探讨在炎性状态下BRF1对IL6(Interleukin 6)、NOS2(Nitric oxide synthase 2)、COX2(Cytochrome c oxidase subunit II)等炎性因子以及自噬和凋亡的影响,同时通过3-MA(3-Methyladenine)和U0126两个抑制剂分别抑制自噬和MAPK/ERK信号通路后,BRF1对炎性因子的影响。最后用咪喹莫特(IMQ)涂抹在脱毛的小鼠背部皮肤上建立银屑病样皮肤炎模型,并皮下注射BRF1腺病毒观察疗效;将鸡二型胶原和弗氏完全佐剂等比例乳化皮下注射小鼠,21天后加强免疫并观察小鼠踝关节部位类风湿关节炎的临床表现。结果通过蛋白及RNA水平鉴定结果可知成功构建了过表达和干扰腺病毒Ad-BRF1/Ad-siBRF1,Western blot及流式细胞分析技术FCM结果显示Ad-BRF1处理巨噬细胞组相对于Ad-GFP对照组自噬和凋亡降低,同时免疫荧光显示BRF1能够降低雷帕霉素诱导的自噬。成功建立了RAW264.7巨噬细胞炎症模型,在LPS、TNFa、IL1β诱导下炎性因子IL6、NOS2、COX2明显增加,且BRF1与自噬的表达成相反的趋势。在LPS诱导炎症的情况下,过表达BRF1能够抑制炎性因子、自噬以及凋亡的增加,而干扰BRF1促进了炎性因子的表达,同时在3-MA及U0126两个抑制剂分别抑制自噬和MAPK/ERK信号通路的情况下,3-MA及U0126有效逆转了BRF1对炎症的抑制作用,证明BRF1抑制炎性因子的表达可能通过下调自噬和MAPK/ERK信号通路来实现的。成功构建了皮肤炎和CIA模型,注射腺病毒并观察对自身免疫性疾病的发生过程中组织结构、自噬、炎症的影响,为后续自身免疫性疾病的机制研究和治疗提供新的治疗靶点。结论在RAW264.7细胞中,BRF1能够抑制细胞的自噬和凋亡,且能够缓解炎症的发生,且这一功能可能依赖于自噬和MAPK/ERK信号通路。同时在免疫性疾病发生过程中自噬和炎性因子的水平增加,BRF1能够缓解咪喹莫特诱导的免疫性皮肤炎。