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恶性肿瘤严重危害人类的健康，虽然手术、化疗和放疗等治疗手段不断改进提高，但是仍有很多患者遭罹肿瘤的复发。从肿瘤生物/免疫治疗方面来打开突破口，寻找优化的综合治疗方案，是现代肿瘤治疗的新途径。肿瘤疫苗、单克隆抗体治疗、细胞因子等佐剂治疗和过继性细胞免疫治疗是近来比较常用的肿瘤免疫治疗方法。肿瘤过继性细胞免疫治疗（Adoptive cellular immunotherapy，ACI或AIT）是指将体外扩增的具有抗肿瘤活性的免疫细胞（包括特异性的和非特异性的）向肿瘤患者回输，直接或间接激发机体免疫应答以杀伤肿瘤细胞，这对细胞免疫功能低下的患者特别适用，其主要的原理是在体外分离得到患者外周血单个核细胞，经过特异性抗原作用和实验室培养后具备了特异性或非特异性杀伤肿瘤的能力，之后将这种细胞扩增到一定数量再回输到患者体内，以预防肿瘤的复发和转移，这在一定程度上解决了患者放、化疗后免疫力差，生活质量低的严重问题，延长了患者的生存时间。目前，多种细胞因子诱导的杀伤性细胞（cytokines induced killers，CIK）已经用于多种恶性肿瘤的辅助治疗，因其兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤特点,被认为是肿瘤过继免疫治疗的希望，但其临床应用依然存在着一些亟待解决的问题，进一步发掘过继免疫治疗细胞潜在的抗肿瘤优势，对于提高肿瘤过继性细胞免疫治疗在肿瘤综合治疗中的地位意义深远，因此本研究运用本所自主研制的CD40激发型抗体5C11联合细胞因子IFN-α和IL-7体外制备一种新型过继免疫治疗细胞，从细胞增殖、细胞生物学特性和细胞的杀伤效应等方面探讨其过继免疫治疗的作用，以期为肿瘤过继性细胞免疫治疗开辟一种新的方案。目的：比较新型方法（CD40激发组）与传统方法（CD3激发组）培养的过继免疫治疗细胞在增殖速度、细胞亚群和生物学特性（T细胞、NK-T细胞、单核细胞、Treg/ICOS+Treg细胞和表达PD-1、CXCR-4的T细胞等）以及体外趋化能力和杀伤肿瘤细胞能力等方面的差异，以期建立体外培养过继免疫治疗细胞的优化方案。方法：常规经Ficoll分离正常人外周血得到外周血单个核细胞（PBMC），于6孔板和24孔板中加入相应细胞因子(CD40激发组：CD40激发型单抗5C11，IFN-α，IL-7；CD3激发组：IFN-γ，IL-2，anti-CD3mAb，IL-1α）后放入培养箱中培养，每隔两天补一次细胞因子液。（1）在培养的不同时间点（第6、9、12天）记录细胞形态并用台盼蓝染色法进行活细胞计数以检测细胞增殖；（2）在培养的不同时间点，运用免疫荧光标记和流式细胞仪分析检测T细胞、NK细胞、NKT细胞、CD14+CD56+CD11c+细胞比例，检测T细胞表达CD62L、CCR7、CXCR-4以及PD-1的变化以及Treg和ICOS+Treg细胞的表达比例；（3）收集培养第9天的细胞，利用Transwell板检测体外培养的过继免疫治疗细胞的体外趋化能力；（4）在培养的第9天收集两组体外培养的过继免疫治疗细胞，将其与人肺癌细胞株A549按照不同的效靶比共同培养72小时后，用CCK-8法检测体外培养的过继免疫治疗细胞杀伤肿瘤细胞的能力。结果：（1）CD3激发组和CD40激发组细胞都出现明显的集落样生长，CD40激发组细胞增殖速度略慢，但二者没有显著性差异；（2）CD3激发组和CD40激发组细胞在T淋巴细胞组成上无显著差异，CD40激发组的NK-T细胞表达显著上调，中央型记忆CD8+T细胞（CD8+TCM）的比例增加，并且在培养的特定时间出现了独特的CD14+CD56+CD11c+细胞群体；（3）和CD3激发组相比，CD40激发组的Treg细胞、ICOS+Treg细胞和表达PD-1的T细胞比例显著降低；（4）CD40激发组培养的过继免疫治疗细胞在第9天时，体外趋化能力强，并且对人肺癌细胞株A549细胞的杀伤活性不亚于CD3激发组。结论：本实验所建立的新型过继免疫治疗细胞体外培养方法能提高培养细胞中NK-T细胞的比例，显著减少Treg细胞的数量，并且在培养的特定时间出现了独特的CD14+CD56+CD11c+细胞群体，为肿瘤过继免疫治疗新方案的开拓做了有益的探索。