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目前,膀胱癌在我国是泌尿系统发病率最高的恶性肿瘤,尿路上皮癌是其最常见的病理类型。寻找特异性膀胱肿瘤标志物以提高膀胱癌诊断及预后判断的准确性是亟待解决的问题。B7-H3是协同刺激分子B7家族重要成员,是典型的Ⅰ型跨膜蛋白分子,属于免疫球蛋白超家族。自从B7-H3展现出肿瘤免疫共调节功能后,众多学者开始关注人体肿瘤组织中B7-H3的表达与临床意义。既有研究显示,B7-H3分子可能作为肿瘤相关抗原在肿瘤的诊断和预后判断中具有重要价值。第一部分B7-H3分子在人膀胱尿路上皮癌组织中的表达及临床意义目的:研究B7-H3分子表达水平与膀胱尿路上皮癌临床病理参数的相关性,探讨其在尿路上皮癌患者肿瘤手术预后的指导意义。方法:1.免疫组织化学法检测膀胱尿路上皮癌患者行部分切除或根治性切除的肿瘤标本中B7-H3分子表达水平。2.卡方检验分析B7-H3表达与膀胱尿路上皮癌临床病理参数关系。3.生存分析Kaplan-Meier法检测患者术后生存情况。结果:1.在134例膀胱尿路上皮癌患者中,肿瘤组织B7-H3阳性高表达93/134例(69.4%),低表达41/134例(30.6%),阳性高表达率明显高于癌旁和正常膀胱组织(15/60例,25.0%;11/60例,18.3%;P<0.05)。膀胱癌组织中,B7-H3表达水平与患者性别、年龄、病理分级、肿瘤分期、复发、淋巴结转移无明显相关(P>0.05),但B7-H3高表达患者的脉管侵犯和肿瘤远器官转移比例明显高于B7-H3低表达患者(69.9%vs.46.3%;49.5%vs.26.8%),差别有统计学意义(P=0.009;P=0.015)。2.生存分析显示,与B7-H3低表达患者相比,B7-H3高表达患者在膀胱部分切除或根治性切除术后的总体生存率及无进展生存率明显降低(P=0.002;P=0.020)。小结:1.膀胱癌细胞高表达B7-H3分子的患者出现脉管侵犯、远处器官转移的比例更高,术后生存率明显低于B7-H3低表达组患者。2.B7-H3分子的表达水平可以作为膀胱癌术后肿瘤进展及患者生存状况的有效预测指标。第二部分人膀胱尿路上皮癌组织中B7-H3分子与CD163~+肿瘤相关巨噬细胞的关系及在预后中的意义目的:检测人膀胱尿路上皮癌组织中B7-H3分子表达水平与CD163~+肿瘤相关巨噬细胞浸润程度(TAMs)的相关性,并探讨两者单独或联合预测膀胱部分切除或根治性切除手术后患者肿瘤进展与死亡风险预后意义。方法:1.免疫组织化学法检测膀胱尿路上皮癌患者行部分切除或根治性切除的肿瘤组织中CD163~+TAMs浸润程度。2.卡方检验分析CD163~+TAMs浸润程度与临床病理参数相关性。3.Spearman检验分析CD163~+TAMs浸润程度与B7-H3分子表达水平相关性。4.Kaplan-Meier法和Cox比例风险模型进行生存分析,并探讨B7-H3分子与CD163~+TAMs对肿瘤进展与死亡风险的协同影响。结果:1.膀胱尿路上皮癌组织中,CD163~+TAMs浸润程度与患者性别、年龄、病理分级、肿瘤分期、复发、淋巴结转移等无明显相关(P>0.05),CD163~+TAMs高度浸润患者的脉管侵犯和肿瘤远转移比例明显高于CD163~+TAMs低度浸润患者(74.6%vs.53.3%;52.5%vs.34.7%),差别有统计学意义(P=0.012;P=0.038)。2.Spearman相关检验显示,膀胱尿路上皮癌组织中B7-H3表达水平与CD163~+TAMs浸润程度呈正相关,有统计学意义(r=0.230,P<0.01)。在134例膀胱尿路上皮癌患者中,生存分析显示CD163~+TAMs浸润程度与患者总体生存时间(OS)、无进展生存时间(PFS)无明显相关性(P=0.074;P=0.090);而且CD163~+TAMs浸润程度与患者总体死亡风险、肿瘤特异性死亡风险及肿瘤进展风险亦无明显相关性(P=0.290;P=0.525;P=0.355)。而在CD163~+TAMs高浸润层组中,B7-H3高表达的患者比B7-H3低表达患者的总体死亡风险、肿瘤特异性死亡风险及肿瘤进展风险均明显升高(P=0.002;P=0.004;P=0.018)。在134例患者队列中,B7-H3高表达组患者的总体死亡风险、肿瘤特异性死亡风险及肿瘤进展风险均明显高于B7-H3低表达组患者(P=0.001;P<0.001;P<0.001);在55例局限性膀胱癌患者中,B7-H3表达水平与总体死亡风险、肿瘤特异性死亡风险及肿瘤进展风险则无相关性(P=0.138;P=0.269;P=0.147)。小结:1.膀胱尿路上皮癌组织中,CD163~+TAMs高浸润患者出现脉管侵犯、远处器官转移的比例更高。2.CD163~+TAMs的浸润程度与B7-H3表达水平有明显的正相关性。在CD163~+TAMs高浸润层组中,B7-H3高表达患者的总体死亡风险、肿瘤特异性死亡风险及肿瘤进展风险均明显高于B7-H3低表达患者。3.CD163~+TAMs浸润程度可以联合B7-H3分子的表达水平作为膀胱癌部分或全切除术后患者死亡风险的预测指标。第三部分RNA干扰B7-H3基因表达对膀胱尿路上皮癌T24细胞恶性行为影响的研究目的:通过shRNA靶向干扰膀胱尿路上皮癌T24细胞B7-H3基因表达,观察B7-H3mRNA、蛋白表达以及细胞增殖、侵袭能力的变化,探讨其影响机制。方法:1.将携带B7-H3 shRNA的重组慢病毒载体LV-B7-H3-RNAi稳定转染T24细胞,建立沉默B7-H3基因表达的T24细胞(T24/B7-H3-siRN)。2.Western blot、RT-PCR实验检测T24/B7-H3-siRNA细胞的B7-H3mRNA和蛋白的表达情况。3.Western blot、RT-PCR实验检测T24/B7-H3-siRNA细胞的基质金属蛋白酶MMP-2 mRNA和蛋白的表达情况。4.MTS增殖实验检测T24/B7-H3-siRNA细胞的增殖能力变化。5.Transwell实验检测T24/B7-H3-siRNA细胞的侵袭能力的变化。结果:1.成功利用重组慢病毒载体建立了外源基因稳定转染的膀胱尿路上皮癌T24细胞系(T24/B7-H3-siRNA)。2.T24/B7-H3-siRNA细胞的B7-H3 mRNA表达水平(0.0952±0.0012)明显低于T24/control siRNA对照组(0.4638±0.0010)以及T24无基因转染细胞组(0.4650±0.0008),差异有统计学意义(P<0.01;P<0.01)。3.T24/B7-H3-siRNA细胞的B7-H3蛋白表达水平(0.1364±0.0015)明显低于T24/control siRNA对照组(0.1772±0.0008)以及T24无基因转染细胞组(0.1783±0.0019),差异有统计学意义(P<0.01;P<0.01)。4.T24/B7-H3-siRNA细胞的MMP-2 mRNA表达水平(0.0654±0.0031)明显低于T24/control siRNA对照组(0.4340±0.0028)以及T24无基因转染细胞组(0.4360±0.0005),差异有统计学意义(P<0.01;P<0.01)。5.T24/B7-H3-siRNA细胞的MMP-2蛋白表达水平(6.0190±0.1339)明显低于T24/control siRNA对照组(16.0327±0.0952)以及T24无基因转染细胞组(16.1658±0.2902),差异有统计学意义(P<0.01;P<0.01)。6.MTS增殖实验显示,T24/B7-H3-siRNA细胞的增殖速度明显低于T24/control siRNA对照组和T24无基因干扰对照组细胞,差异有统计学意义(P<0.01;P<0.01)。7.Transwell侵袭小室实验显示,T24/B7-H3-siRNA细胞通过人工基底膜(Matrigel基质)的细胞数(58.4±2.0)明显少于T24/control siRNA对照组(110.2±6.4)和无基因转染T24细胞组(113.6±7.8),差异有统计学意义(P<0.01;P<0.01)。小结:1.该部分实验利用重组慢病毒载体携带小干扰RNA(siRNA)稳定转染膀胱尿路上皮癌细胞T24,靶向干扰B7-H3基因表达,成功建立B7-H3低表达的T24细胞系。2.T24/B7-H3-siRNA组的细胞增殖、侵袭能力明显受到抑制,提示B7-H3参与了膀胱癌的进展、转移过程。结论:1.膀胱尿路上皮癌细胞B7-H3分子的表达阳性率明显高于癌旁及正常膀胱组织。B7-H3高表达患者更容易出现脉管侵犯、远处器官转移。B7-H3分子的表达水平有可能作为膀胱癌部分切除或根治性切除术后肿瘤恶性进展及患者生存时间的预测指标。2.膀胱尿路上皮癌组织中CD163~+TAMs高浸润患者更容易出现脉管侵犯、远处器官转移。CD163~+TAMs的浸润程度与B7-H3表达水平有统计学意义的正相关性。B7-H3分子的表达水平可以单独或联合CD163~+TAMs浸润水平作为膀胱癌部分切除或根治术后死亡风险的预测指标。CD163~+TAMs浸润水平不能单独作为患者术后生存时间和死亡风险的独立预测指标。3.通过shRNA干扰T24细胞B7-H3基因表达,T24细胞B7-H3mRNA、蛋白表达以及细胞增殖、侵袭能力均显著降低。B7-H3可能参与T24细胞的增殖、侵袭等肿瘤恶性行为,可以作为膀胱癌基因治疗的潜在靶点。