论文部分内容阅读
[目的]1、掌握2015年云南省AFP病例流行病学特征,描述NPEV阳性病例三间分布情况;2、熟悉NPEV的基因特征分析原理、方法及步骤,了解其分子进化及基因重组情况;3、为NPEV引起的AFP病例的防控提供理论依据;4、提供云南省NPEV研究的基础资料。[方法]1、细胞培养,L20B细胞及RD细胞的培养,确保使用的细胞达到实验室病毒分离的标准。对2015年云南省AFP监测系统中的病例标本按照相关标准规范处理,提取便悬液采用细胞培养的方法进行病毒分离。2、对病毒分离阳性标本提取核酸并进行VP1完整编码区序列的扩增和测定。将获取的VP1完整编码区序列,在NCBI提供的BLAST程序搜索,利用MEGA5.0软件对分离株及对应原型株进行核苷酸和氨基酸序列比对,通过HEVs分子定型方法进行序列比对和型别鉴定。3、收集病例的基本信息,利用描述流行病学方法描述其分布特征。4、将鉴定出的EV71分离株与GenBank中其他国家和地区分离株,利用MEGA5.0软件,对其VP1区核苷酸序列及其推导的氨基酸序列进行同源性比较;以邻位法(Neighbor-joining Method)构建VP1区系统发生树,对分离株进行亲缘进化分析。5、利用VP1区基因特征对CVB5分离株进行进一步分型研究。对一株EV71分离株进行全基因组序列测定,对其与原型株及其代表株基因组序列进行比对;使用Simplot3.5.1软件,分析其在基因组中的重组情况。[结果]云南省2015年213例AFP病例流行病学特征与全国基本一致,AFP病例中共检测到23株NPEV,7株为HEVA组,分离到的EV71均属于C4亚型。14株为人类肠道病毒B组,分离到的CVB5均属于D亚型,2株为人类肠道病毒C组,未分离到人类肠道病毒D组病毒及新型人类肠道病毒。AFP病例流行病学特征为:16个州(市)中15个州(市)有病例报告,仅迪庆州无病例。全年各周均有病例报告,未见明显季节分布。男性135例,女性78例,男女性别比1.73:1。NPEV阳性病例的分布特征为:人群分布为男性12例,女性11例;地区分布为德宏5例,普洱3例,除大理及迪庆没有外,其他州市均为1～2例;时间分布为4、5月份各有4例,6、7月份各有3例,4～7月占总病例数的60.9%,除2、9月份没有以外其他月份均为1~2例。EV71分离株VP1区基因特征为6株EV71聚为一组,6株EV71与C4a亚型代表株最为接近;CVB5分离株VP1区基因特征为3株CVB5聚为一组,并且与代表株JN712675、KF751191等最为接近。本次CVB5分离株及其代表株可划分为A、B、C、D四个基因型。2015年EV71分离株32-YN-2015与其他EV71代表株未发现基因重组情况,但在P2段的2A区CA4代表株High Point、P2段的2C区CA5代表株Swartz与32-YN-2015分离株以及P3段的3D区CA16代表株G-10同样与32-YN-2015分离株存在基因重组事件。另外,在非编码区5’UTR段,CA8代表株Donovan与32-YN-2015也存在基因重组情况。[结论]本研究发现,2015年云南省AFP病例中NPEV以HEV A,B,C组为主,未分离到D组人类肠道病毒和新型人类肠道病毒。分析NPEV阳性病例分布特征可看出男女比例无明显差异,大多数病例均在5岁及以下,病例主要分布在德宏及普洱两个地区,从分布时间上看,NPEV阳性病例主要分布在4～7月份。分离到的6株EV71属于C4a亚型,而分离到的3株CVB5则属于D亚型,与引起AM的山东分离株(JN712675)以及引起HFMD的安徽分离株(KF751191)有密切关系。EV71分离株32-YN-2015基因重组研究结果表明,病毒型内未发现基因重组情况,但在型间,分离株32-YN-2015与CA4、CA5、CA8和CA16存在基因重组情况。