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子宫内膜异位症(endometriosis,EM)是育龄期妇女的常见病和多发病,可导致痛经、月经失调和不孕等临床症状,严重影响了女性的健康。近年来EM的发病率有明显增高的趋势,可高达10%～15%。EM病变广泛,形态多样,虽是良性疾病,却具有浸润、转移和复发的恶性生物学行为,成为难治之症。其病因和发病机制至今尚未明确。在此领域的不断研究,使广大学者逐渐认识到:免疫功能异常对EM的发病可能有着重要的影响,特别是机体免疫平衡状态被打破,使EM得以进一步的发生与发展。已有研究表明,在大多数EM患者中,特别是期别较晚的EM,机体Th类细胞因子的平衡发生变化,其单个核细胞功能发生改变,从而使其NK细胞、T细胞的细胞毒作用被抑制,从而可能促进子宫内膜在异位的种植。辅助性T细胞(helper T,Th)亚群及其所分泌的细胞因子的研究为了解EM患者的免疫状态,以及寻找免疫治疗方法提供了新的思路。EM患者Th1细胞功能是抑制的,Th1Th2平衡状态被打破,向Th2方向漂移,因此,Th2细胞因子水平升高,可能是EM患者呈现免疫防御功能抑制,从而无法清除逆流入腹腔的内膜细胞,导致其种植与生长的原因之一。先前研究也表明,EM患者全身和局部的催乳素(Prolactin,PRL)水平多呈增高的状态,在位及异位内膜的PRL及催乳素受体(PRLR)也发生变化,大部分EM患者伴有高催乳素血症并合并有不孕,这种现象日益受到人们的重视。鉴于子宫内膜是垂体外PRL合成的重要部位,因此,EM患者的高PRL血症可能是导致EM发生发展的重要因素。但目前为止,关于PRL与EM的发生发展及与Th平衡之间到底有何关系,至今仍是一个谜,三者的关系值得进一步研究。目前,国内外对EM患者Th类细胞因子与催乳素相关的研究报道较少,尤其是对于催乳素在调节EM患者Th1/Th2平衡的研究尚未见报道。因此,本研究以EM患者为对象,检测其Th1(以IFN-γ为代表)/Th2(以IL-4为代表)两类细胞因子的变化情况,并进一步运用不同浓度重组人催乳素(recombination human prolactin, rhPRL)对EM患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)进行调节,以期探讨催乳素在EM发病中对Th细胞因子的作用。目的1.探讨EM患者外周血总体T、NK细胞含量上的差异2.探讨EM患者外周血NK细胞杀伤功能3.检测EM患者外周血细胞内外所表达的Th1Th2型细胞因子的表达情况。4.探讨催乳素在体外对EM患者Th平衡的影响作用。方法1.流式细胞术(FACS)检测子宫内膜异位症患者PBMC中T淋巴细胞及NK细胞的数量变化情况随机选取因子宫内膜异位症(endometriosis,EM)卵巢异位囊肿行剖腹手术的EM患者28例及同期因不孕症行腹腔镜检查或因子宫肌瘤行子宫全切术的非EM患者共20例,手术前抽取肘静脉血3ml,密度梯度法分离外周血单个核细胞,流式细胞术检测外周血T淋巴细胞(CD3+)及NK细胞(CD3-CD56+)数量的变化情况。2.磁珠分选(MACS)出外周血NK细胞, LDH法检测其杀伤功能病例及对照组选择同上。手术前抽取颈静脉血20ml,密度梯度法分离外周血单个核细胞,MACS分离出NK细胞,流式细胞术检测其纯度,并用LDH法测其杀伤功能的变化。3.ELISA方法检测EM患者外周血Th1、Th2细胞因子变化情况病例及对照组选择同上。手术前抽取肘静脉血3ml,离心收取上清,于-80。C保存留作检测。采用酶联免疫吸附法(ELISA),IFN-γ、IL-4检测试剂盒检测分析。4.流式细胞术(FACS)检测EM患者外周血NK表达的Th1、Th2因子的变化情况随机选取因子宫内膜异位症卵巢异位囊肿行剖腹手术的EM患者28例及同期因不孕症行腹腔镜检查或因子宫肌瘤行子宫全切术的非EM患者共20例,手术前抽取肘静脉血5ml,分离单个核细胞,流式细胞术检测外周血NK细胞内Th1类细胞(CD3-CD56+ IFN-γ+细胞)和TH2类细胞(CD3-CD56+ IL-4+细胞)的表达情况。5.ELISA方法检测重组人催乳素对EM患者PBMC Th1/Th2细胞外细胞因子的调节作用无菌收集24例EM患者的抗凝外周血5ml,密度梯度离心法无菌分离外周血单个核细胞(PBMC),24孔板培养,每孔5×105个细胞。设不同浓度重组人催乳素(rhPRL)刺激组(6.25ng/ml、12.5ng/ml、25ng/ml、100ng/ml、200ng/ml)和空白对照组(0ng/ml),共培养72小时后收集上清培养液,于-80。C保存留作检测。酶联免疫吸附法(ELISA)检测上清中Th1类细胞因子(IFN-γ)和Th2类细胞因子(IL-4)的表达情况。6.流式细胞术(FACS)检测重组人催乳素(rhPRL)对EM患者外周血细胞内Th1Th2因子的调节作用无菌收集15例EM患者的抗凝外周血10ml,无菌分离外周血单个核细胞(PBMC),24孔板培养,每孔5×105个细胞。设不同浓度重组人催乳素(recombination human prolactin, rhPRL)刺激组(12.5ng/ml、50ng/ml、200ng/ml)和空白对照组(0ng/ml),共培养72小时后离心收集细胞。流式细胞术(FACS)检测外周血细胞内Th1类(IFN-γ+)和Th2类(IL-4+)细胞因子的表达情况。结果1. EM患者外周血总T细胞, NK细胞的含量变化EM患者外周血CD3+T细胞占外周血总淋巴细胞比率为(70.41±7.86)%,与对照组(71.81±4.30)%比较,无统计学差异(P >0. 05)。EM患者外周血CD3-CD56+的NK细胞比例为(4.93±0.87)%与对照组(5.97±2.15)%比较,无明显变化。(P >0. 05)。2. EM患者外周血NK细胞杀伤功能的改变经MACS分离外周血NK细胞纯度可达到97%以上; EM患者NK细胞在效靶比较低时杀伤率较低,随效靶比升高,杀伤率随之上升,10﹕1时杀伤率为49%,20﹕1时杀伤率率为54%。对照组NK细胞对K562细胞的杀伤率在39%-63%之间。实验组与对照组之间的杀伤率在效靶比为5﹕1和10﹕1时有显著性差异(P<0.05)。EM患者外周血NK细胞杀伤功能较正常人NK细胞降低。3. EM患者外周血Th1类因子(IFN-γ)和Th2类因子(IL-4)表达情况:ELISA法检测EM患者外周血Th1类因子(IFN-γ)和Th2类因子(IL-4)表达情况,结果显示: EM患者外周血IFN-γ水平为(109.42±27.54)pg/ml ,较正常对照组(154.27±39.12) pg/ml明显降低(P<0.05) ,而IL-4水平为(14.47±1.33) pg/ml ,较对照组[(8.08±0.55) pg/ml]增加(P < 0.05)。代表Th平衡的Th1/Th2(IFN-γ/IL-4)比值,EM患者为(3.65±1.59) ,较对照组(7.11±1.37)降低(P<0.05)。4. EM患者外周血NK细胞所表达的1类因子(CD3-CD56+ IFN-γ+)和2类因子(CD3-CD56+ IL-4+)表达情况FACS检测EM患者外周血NK细胞所表达的1类因子(CD3-CD56+ IFN-γ+细胞)和2类因子(CD3-CD56+ IL-4+),结果显示:EM患者外周血NK胞所表达CD3-CD56+ IFN-γ+表达比例为(6.84±2.75)%,明显低于对照组[(16.55±7.00)% ](P<0.05) ,EM患者CD3-CD56+ IL-4+表达比例为(3.62±1.28)%,高于对照组[(1.29±0.55)%](P<0.05)。5. ELISA法检测不同浓度rhPRL对EM患者PBMC Th1Th2因子的调节作用rhPRL对EM患者PBMC调节Th1类Th2类细胞因子的表达情况结果显示:低浓度rhPRL(12.5ng/ml)上调Th1类细胞因子(IFN-γ)的表达,随rhPRL浓度的升高,其上升趋势减缓,主要表现为下调作用;rhPRL对Th2类因子(IL-4)的作用同前,即低浓度(12.5ng/ml)上调IL-4的表达,随rhPRL浓度增高,表现为IL-4分泌上升趋势逐渐减缓。代表TH平衡的Th1/Th2(IFN-γ/IL-4)比值,在低浓度(12.5ng/ml)rhPRL作用下,比值达到最大,在较高浓度rhPRL存在时,其比值减小,表现为抑制作用。6. FACS检测不同浓度rhPRL对EM患者细胞内1类(IFN-γ+) 2类(IL-4+)细胞因子的调节作用rhPRL对EM患者细胞内1类(IFN-γ+),2(IL-4+)类细胞因子调节作用的结果显示:低浓度(12.5ng/ml)上调PBMC胞内1类因子(IFN-γ+)的表达,随浓度的增加,上调作用不明显,与此类似,rhPRL对PBMC胞内2类因子(IL-4+)的调节,低浓度(12.5ng/ml)时抑制IL-4的表达,而在高浓度存在时,其抑制作用明显减弱。结论正常人及EM患者外周血总T、NK细胞在数量上没有差异,但EM患者NK细胞杀伤功能有所减低;EM患者外周血及NK细胞内表达的1、2细胞因子平衡状态发生改变,表现出Th2优势状态;rhPRL对EM患者细胞内外的Th1/Th2平衡具有双向调节作用。