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目的人巨细胞病毒(HCMV)可造成人体多系统多方面的严重损害,应用RNA干扰技术抑制HCMV感染具有诱人的前景。HCMV UL122基因和UL54基因是HCMV复制和存活的必需基因,在HCMV与宿主细胞相互作用及抗HCMV药物作用中起不可或缺的作用。但是目前对UL122基因和UL54基因的有效小干扰RNA(siRNA)作用靶位尚缺乏全面的认识。因此有必要进一步研究,以明确UL122基因和UL54基因的有效siRNA作用靶位,开发其潜在应用价值,为应用RNA干扰技术抑制HCMV感染奠定实验基础。方法本研究主要包括以下四大部分：(1)融合蛋白表达载体的构建：设计引物应用PCR法从HCMV AD 169株DNA中扩增出UL122基因的优势表位相应区域以及UL54基因的全长,并克隆入pEGFP-N1质粒载体,构建pUL122-EGFP、pUL54-EGFP融合蛋白表达载体,实现UL122基因和UL54基因的体外表达。(2)短发夹结构RNA (shRNA)表达载体的构建：针对UL122及UL54基因设计siRNA作用靶位点,合成相应序列并克隆入pAVU6+27质粒载体,构建针对UL122和UL54基因的shRNA表达载体。(3)筛选高效作用靶位：将shRNA表达载体和融合蛋白表达载体共转染入AD293细胞,应用实时荧光定量PCR、流式细胞检测技术和倒置荧光显微镜从mRNA和蛋白质水平筛选出理想、高效的siRNA作用靶位。(4)慢病毒载体构建及转染：参照上述筛选出的高效siRNA作用靶位,构建能够表达shRNA的慢病毒载体,并将此慢病毒载体和融合蛋白表达载体转染细胞,应用流式和Western Blot法检测shRNA的慢病毒表达载体对HCMV目标基因体外表达的抑制作用。结果(1)本研究成功构建融合蛋白表达载体pUL122-EGFP和pUL54-EGFP,实现UL122基因和UL54基因的体外表达。该融合蛋白表达载体在转染后24小时和48小时均能表达绿色荧光,但是转染后48小时表达的绿色荧光明显强于转染后24小时表达的绿色荧光。(2)成功将一小段设计合成好的、具有形成shRNA能力的DNA序列插入pAVU6+27质粒载体U6启动子的下游,构建成具有表达shRNA能力的重组质粒载体,分别命名为psiUL122-1、psiUL122-2、psiUL122-3、psiUL54-1、psiUL54-2和psiUL54-3。(3)将融合蛋白表达载体pUL122-EGFP分别与shRNA表达载体psiUL122-1、psiUL122-2和psiUL122-3共转染。倒置荧光显微镜下发现转染后24h重组质粒载体psiUL122-1、psiUL122-2和psiUL122-3对融合蛋白的表达无明显抑制作用,转染后48hpsiUL122-1和psiUL122-2对融合蛋白荧光表达具有明显抑制作用,而psiUL122-3对融合蛋白荧光表达只有轻度抑制作用。流式(FCM)结果显示转染后48hpsiUL122-1、psiUL122-2和psiUL122-3对融合蛋白的抑制率分别为82.0±1.0%、79.5±2.5%和53.5±2.5%,与对照组相比差异有统计学意义(p<0.05),且psiUL122-1和psiUL122-2对pUL122-EGFP的抑制效果较psiUL122-3明显。荧光定量PCR结果显示psiUL122-1、psiUL122-2和psiUL122-3对融合蛋白mRNA的抑制率分别为97.3±0.6%、98.0±0.1%和90.0±3.5%。(4)将融合蛋白表达载体pUL54-EGFP分别与shRNA表达载体psiUL54-1、psiUL54-2和psiUL54-3共转染。倒置荧光显微镜下发现转染后24h重组质粒载体psiUL54-1、psiUL54-2和psiUL54-3对融合蛋白的表达无明显抑制作用,转染后48h psiUL54-1对融合蛋白荧光表达具有明显抑制作用,而psiUL54-2和psiUL54-3对融合蛋白表达只有轻微抑制作用。流式结果显示转染后48hpsiUL54-1对融合蛋白的抑制率为85.4±1.2%,与对照组相比具有显著差异(p<0.05),而psiUL54-2和psiUL54-3对融合蛋白的抑制率分别为14.9±2.9%和20.4±6.2%,与对照组相比没有显著差异(p>0.05)。荧光定量PCR结果显示psiUL54-1对pUL54-EGFP融合蛋白基因mRNA的抑制率为97.4±0.7%,与对照组相比差异有统计学意义(p<0.05),而psiUL54-2和psiUL54-3的抑制率分别为20.3±6.9%和28.2±5.6%，与对照组相比无显著差异(p>0.05)。(5)参照psiUL54-1对UL54基因体外表达的高效抑制作用,进一步成功构建针对UL54基因的慢病毒表达载体。将慢病毒载体与融合蛋白表达载体pUL54-EGFP共转染,倒置荧光显微镜下发现慢病毒载体PscSI-1对融合蛋白荧光表达在转染后24h有轻度抑制作用,在转染后48h和72h具有明显抑制作用,而慢病毒载体PscSI-2、PscSI-3和PscSI-4对融合蛋白荧光表达在各时间点均无明显抑制作用。Western Blot检测显示PscSI-1与融合蛋白表达载体在1：2和1：1比例下均有明显抑制作用,PscSI-3在1：1比例下有轻度抑制作用,而PscSI-2和PscSI-4在两种比例下均无明显抑制作用。结论1.融合蛋白表达载体pUL122-EGFP和pUL54-EGFP能够成功表达融合蛋白UL122-EGFP和UL54-EGFP,实现UL122基因和UL54基因的体外表达,又能通过融合蛋白表达后仍能发出绿色荧光。融合蛋白的表达在转染后48小时较为明显。2.UL122基因的靶位点618-638bp (psiUL122-1和1103-1123bp(psiUL122-2)是高效的siRNA作用靶位点,是应用RNA干扰抗HCMV感染基因治疗的潜在靶位点。UL122基因的靶位点1414-1434bp(psiUL122-3)不是高效的siRNA作用靶位点。3.靶位点1479-1497bp (psiUL54-1和PscSI-1)是一个高效的siRNA作用靶位点,是应用RNA干扰抗HCMV感染基因治疗的潜在靶位点。靶位点2419-2437bp(psiUL54-2)、靶位点2886-2904bp(psiUL54-3和PscSI-2)、靶位点3058-3076bp (PscSI-3)和靶位点419-437bp(PscSI-4)不是高效的siRNA作用靶位点。4.重组干扰质粒转染后48h对融合蛋白的抑制作用较明显,但转染24小时无明显抑制效果。5.与质粒载体相比,慢病毒载体是一种转染率高、起效快、抑制作用持久且高效的基因载体,具有重要的应用价值。6.慢病毒载体与质粒载体在筛选有效siRNA作用靶位方面具有一致性。