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普鲁兰酶是一类应用价值很高的淀粉脱支酶,但是从自然界分离得到的天然菌株,分泌普鲁兰酶的能力有限,难以大规模应用在工业化生产中。利用基因工程技术,可以改善普鲁兰酶的酶学性质和蛋白分泌表达水平。为了获得酶学性质更加优良的酶蛋白和进一步提高普鲁兰酶的表达水平,研究人员开始对普鲁兰酶蛋白的分子结构进行解析,并且通过计算模拟设计对酶蛋白进行了突变改良研究。本研究将来源于Bacillus naganoensis(ATCC53909)的普鲁兰酶基因转入大肠杆菌中进行诱导表达,重组酶最适温度60℃,最适pH4,该酶非常适合在淀粉工业加工中应用,与其他的糖化酶配合使用,来提高淀粉酶的利用效率。但是,该酶的热稳定性较差,在60℃保温10 min酶活性完全丧失,阻碍了其应用。因此提高Pul的热稳定性是本研究的重点。通过查阅文献和序列比对,找到了四条和来源于Pullulanibacillus naganoensis的普鲁兰酶相似性较高的酸性普鲁兰酶序列,依据同源建模对普鲁兰酶Pul的不同结构域分别进行N端或者C端删除突变,最后确定删除的位置。截短得到的突变体中只有Pul-D1F保持优良的酶学性质,蛋白表达较好,最适温度与野生酶Pul相同,都是60℃,且最适pH4.5,满足淀粉加工应用的pH范围。但是进一步的N端或C端截短普鲁兰酶活性完全丧失,说明这些结构域对维持酶蛋白的结构和功能具有重要作用。在Pul-D1F的基础上进行定点突变,将构建的9个突变体在60℃保温0、2、5、10、20、30、40、50、60 min后,N387D的热稳定性最好,其次是D328H和A414P,这三个点在60℃保温20 min后的残余酶活分别为58.32%、48.37%、13.06%。由于多点突变通常情况下比单点突变对蛋白质的热稳定性影响更大,为了进一步提高普鲁兰酶的热稳定性,对热稳定性较好的三个单点N387D、D328H和A414P,进行两点及三点的组合突变,所得的突变体A414P/N387D/D328H的热稳定性最好,其次是N387D/D328H和A414P/N387D,这三个点在60℃保温60 min后的残余酶活分别为57.47%、40.88%、26.54%。