论文部分内容阅读
[目的]肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)为肿瘤死因子家族成员之一,因其仅诱导病毒感染细胞、转化细胞和肿瘤细胞凋亡,而对正常细胞无毒性,故倍受关注。TRAIL与化疗和放疗联合应用对肿瘤细胞有协同凋亡诱导效应,目前已进入临床Ⅰ和Ⅱ期试验。虽然TRAIL能诱导多数肿瘤细胞凋亡,但也有部分肿瘤细胞对其不敏感,且TRAIL对这些不敏感的肿瘤细胞有促增殖作用。端粒酶的主要功能是解决端粒的“末端复制问题”,此外还参与细胞凋亡抑制、DNA损伤修复和耐药性的调控。端粒酶活性下降和端粒缩短后,肿瘤细胞对化疗和放疗敏感性显著增加。近年研究提示,TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡的选择性可能与端粒酶活性表达的选择性相关,降低肿瘤细胞端粒酶活性可能增加TRAIL诱导凋亡的敏感性。由于端粒酶逆转录酶(hTERT)是端粒酶的催化亚单位和限速酶,在端粒酶活性维持中起关键作用,因而hTERT可能是治疗肿瘤的新靶点。既往的研究发现,增加hTERT的表达能抑制TRAIL诱导凋亡作用,但其作用机制尚未进一步阐明。干扰hTERT表达是否会克服肿瘤细胞对TRAIL的耐药性,是否会提高肿瘤细胞对TRAIL诱导凋亡的敏感性,目前也不清楚。为此我们构建了hTERT干扰真核表达载体,并转染消化道肿瘤细胞,观察了hTERT干扰对TRAIL诱导消化道肿瘤细胞凋亡的影响,并进一步探讨了其作用机制。[方法]人工合成hTERT干扰序列并定向克隆到小干扰RNA真核表达载体pSilencer 3.1-H1 neo,形成重组质粒pSilencer 3.1-H1 neo-shTERT。重组质粒转化DH5α大肠杆菌后经PCR扩增、酶切和DNA测序法鉴定出含有正确干扰序列的重组质粒。重组质粒和对照质粒pSilencer 3.1-H1 neo分别转染胃癌、肝癌和结肠癌细胞,经PCR法和RT-PCR法鉴定出hTERT干扰效果最佳的细胞克隆。用细胞生长曲线法、苏木素-伊红染色法、β-半乳糖苷酶染色法、流式细胞术法、吖啶橙/溴化乙锭染色法、TRAP放射自显影法、TALA放射自显影法和免疫印迹法分别检测hTERT干扰对细胞增殖、细胞形态、细胞衰老、细胞周期、细胞凋亡、端粒酶活性、端粒长度和细胞凋亡相关蛋白表达。[统计学分析]用统计软件SPSS 11.5建立数据库,采用单因素重复试验方差分析法分析hTERT干扰率、细胞增殖、细胞衰老、细胞周期、端粒酶活性、端粒长度和凋