背景:环状RNA(circRNA)是一类闭合环状结构的非编码RNA,不易受到RNA核酸外切酶或RNase R酶的降解,较mRNA能更稳定的存在于外周循环血中,正成为非侵入分子诊断研究的热点。同时也正由于这种环状结构,造成了逆转录过程中的“滚环现象”和对下一步qPCR定量检测方法的影响。微滴数字PCR(droplet digital PCR:ddPCR)是一种基于终点分析阳性反应微滴数和阴性反应微滴数的绝对定量检测方法,而不依赖于反应过程中荧光信号强度的具体变化率,因此ddPCR可望克服这一技术难题,提高对循环血中痕量的游离环状RNA定量检测的准确性。另一方面,环状RNA在循环血中的稳定性,和样品处理过程对环状RNA定量检测数据变异度的影响,是影响环状RNA作为非侵入性分子诊断研究的前提。目的:本研究首先探讨环状RNA反转录过程中存在的“滚环现象”对qPCR定量检测的影响,并通过对比RT-qPCR和RT-ddPCR两种不同检测方法对环状RNA表达水平定量检测的结果,拟评估ddPCR用于定量检测环状RNA的有效性。最后本研究运用ddPCR检测了循环血中游离环状RNA的稳定性和样本处理过程对环状RNA浓度的影响,评估环状RNA作为分子标志物的可行性。方法:实验一、环状RNA逆转录(RT)过程中的“滚环现象”对RT-qPCR定量检测结果的影响:(1)抽取外周静脉血,提取总RNA,与RT反应物混合后,平均分为5等分;(2)分别给予15min(分钟),30min,60min,90min,和120min的逆转录反应,获得不同的cDNA产物,进一步行PCR反应,qPCR和ddPCR反应;(3)对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳观察条带,并比较qPCR和ddPCR对相同cDNA的定量结果。实验二、环状RNA在血清和血浆中的稳定性:(1)抽取外周静脉血于血清管和EDTA抗凝管,然后分为2组;(2)组1的血清管和EDTA抗凝管样本,立即给予2步离心法,分别获得血清和血浆,然后分离了的血清和血浆于室温保存预设的时间点后,提取RNA,进行RT-ddPCR反应。组2的血清管和EDTA抗凝管样本,先予室温保存预设的时间点后,再给予2步离心法,分别获得血清和血浆,并提出RNA,进行RT-ddPCR反应;(3)对结果进行统计分析。结果:(1)环状RNA的RT-PCR反应可产生多条带产物,随RT反应时间的延长,长条带产物增加,表明环状RNA特殊的闭合环状结构使其在逆转录过程中产生“滚环现象”,可生成包含外显子串联体的长单链cDNA。(2)随着RT反应时间的延长,qPCR对环状RNA的定量结果增加,而ddPCR对环状RNA的定量结果保持不变。(3)环状RNA在及时分离的血清/血浆样本可稳定存在达24小时。(4)6小时内分离血细胞,不影响环状RNA在血清/血浆中的浓度。(5)环状RNA在延迟24小时分离血细胞的血清/血浆中浓度下降。结论:ddPCR不受逆转录过程中“滚环现象”产生的长单链cDNA的干扰,较qPCR能更准确地用于环状RNA的定量检测。环状RNA可在人血清和血浆中被检测到,并在及时分离血细胞的血清/血浆样本中稳定存在达24小时,可作为疾病诊断的潜在标志物。但血细胞的延迟分离可显著影响环状RNA在外周血中的浓度,因此在进行分子标志物的研究时,需及时处理样本,分离血细胞,以减少研究数据结果的变异性。