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研究发现,拮抗P2X7受体可明显减轻缺血/再灌注导致的大脑损伤,且拮抗P2X7受体可抑制细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase,E RK)激酶的激活,因此本实验主要是探讨ERK激酶在拮抗P2X7受体抗大鼠脑缺血/再灌注损伤中的作用及可能机制,实验中使用P2X7受体的拮抗剂亮蓝G(Brilliant Blue G,BBG)及ERK激酶的抑制剂PD98059用于研究。在体实验:制备大鼠的大脑中动脉栓塞模型,进行大脑的缺血/再灌注。离体实验:原代培养星形胶质细胞,制备星形胶质细胞的缺氧/复氧模型以模拟在体的大鼠大脑缺血/再灌注。目的:探讨拮抗P2X7受体对大鼠脑缺血/再灌注损伤的作用及可能机制。方法:1.大鼠随机分为5组:假手术(sham)组,缺血/再灌注(I/R)组,缺血/再灌注+BBG(I/R+BBG)组,缺血/再灌注+PD98059(I/R+PD98059)组,缺血/再灌注+BBG+PD98059(I/R+BBG+PD98059)组。采用线栓法建立大鼠大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型,缺血2 h再灌注24 h后,采用Longa 5分法对大鼠进行神经行为学评分;TTC染色法检测脑梗死体积的变化;Western blot法检测P2X7受体、凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2以及ERK、phospho-extracellular signal-regulated kinase(p-ERK)、connexin 43(Cx43)的蛋白表达变化。于缺血前20 min尾静脉注射PD98059 0.3 mg·kg-1,缺血后30 min腹腔注射BBG 30 mg·kg-1。保证每组模型制备成功大鼠10只。2.星形胶质细胞的实验分组。实验分组:正常对照(control)组、缺氧/复氧(H/R)组、缺氧/复氧+BBG(H/R+BBG,BBG的终浓度为50 n M)组,缺氧/复氧+PD98059(H/R+PD98059,PD98059的终浓度为50μM)组,缺氧/复氧+BBG+PD98059(H/R+BBG+PD98059)组。MTT法检测星形胶质细胞存活率;Hoechst 33258检测星形胶质细胞凋亡率;Western blot检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2以及ERK、p-ERK、Cx43蛋白表达变化;荧光示踪法检测各组星形胶质细胞间缝隙连接的功能。结果:1.脑缺血2h,再灌注24h,Longa 5分法对大鼠进行神经行为学评分和TTC染色法检测大鼠脑梗死体积,结果显示,缺血/再灌注大鼠的神经行为学评分和脑梗死体积百分率显著增高,P2X7受体拮抗剂亮蓝G(BBG)预处理后或ERK抑制剂PD98059预处理后,大鼠神经行为学评分和脑梗死体积百分率均显著下降,BBG与PD98059合用后,大鼠神经行为学评分及脑梗死体积百分率进一步下降。2.大鼠脑组织中蛋白表达变化的结果显示,脑I/R组大鼠脑组织中p-ERK、Cx43蛋白表达及凋亡相关蛋白Bax与Bcl-2的比值均显著升高。使用P2X7受体拮抗剂BBG或ERK抑制剂PD98059预处理后,大鼠脑组织中p-ERK,Cx43蛋白表达及Bax与Bcl-2的比值均下降。BBG合用PD98059预处理后,大鼠脑组织中p-ERK、Cx43蛋白表达水平及Bax与Bcl-2的比值进一步下降低。3.采用MTT法检测各组星形胶质细胞的存活率。与正常组相比,缺氧/复氧后的星形胶质细胞存活率显著下降,使用P2X7受体拮抗剂BBG预处理或ERK抑制剂PD98059预处理,细胞的存活率增加,BBG与PD98059合用后,细胞的存活率进一步增加。4.采用Hoechst 33258法检测各组星形胶质细胞的凋亡情况。与正常组相比,Hoechst 33258结果显示,缺氧/复氧后星形胶质细胞凋亡显著升高,使用P2X7受体拮抗剂BBG预处理后或ERK抑制剂PD98059预处理后,细胞凋亡率明显下降,BBG与PD98059合用后,细胞凋亡率进一步下降。5.p-ERK、Cx43蛋白表达及凋亡相关蛋白的检测。与正常组相比,缺氧/复氧后细胞的p-ERK、Cx43蛋白表达增加,Bax/Bcl-2比值增加,使用P2X7受体BBG预处理后或ERK抑制剂PD98059预处理后,p-ERK、Cx43蛋白表达明显下降,Bax/Bcl-2比值下降,BBG与PD98059合用后,进一步降低p-ERK、Cx43蛋白表达,Bax/Bcl-2比值进一步下降。6.采用荧光示踪法检测细胞间缝隙连接功能的变化。结果显示,与正常组相比,缺氧/复氧后细胞间的缝隙连接功能增加,使用P2X7受体拮抗剂BBG预处理后或ERK抑制剂PD98059预处理后,缝隙连接功能显著下降,BBG与PD98059合用后,星形胶质细胞间的缝隙连接功能进一步下降。结论:1.拮抗P2X7受体减轻脑缺血/再灌注损伤可能与其抑制ERK激酶有关。2.抑制ERK激酶伴随着缝隙连接功能和Cx43蛋白表达的下降。