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背景:酒精性肝病(alcoholic liver disease,ALD)是由于长期大量饮酒而造成的肝脏损伤,包括脂肪肝、肝炎、肝纤维化、肝硬化等一系列发展进程。近几年酒精性肝病占同期肝病患者的比例不断增多,酒精性肝硬化在肝硬化病因构成比也逐渐增大。有研究表明β-catenin作为一种重要的转录因子在肝脏的生长、发育、再生、代谢等方面发挥着重要的作用。β-catenin在细胞中分布的变化以及活性与其乙酰化水平密切相关。丹酚酸A是丹参中提取的一种水溶性有效成分,其对ALD的治疗作用国内外未见报道。目的:探讨丹酚酸A对ALD的治疗作用及其相关分子机制,研究SIRT1对β-catenin的去乙酰化在ALD中的作用。方法:1、丹酚酸A在ALD中的保护作用的研究60只雄性SD大鼠随机分为五组,如下:(A)正常对照组;(B)丹酚酸A正常给药组(16mg/kg);(C)Liber-DeCarli酒精液体饲料喂养组;(D)Liber-DeCarli酒精液体饲料+丹酚酸A低剂量(8mg/kg)组;(E)Liber-DeCarli酒精液体饲料+丹酚酸A高剂量(16mg/kg)组。将大鼠按上述分组喂养八周,模拟ALD模型。八周后腹主动脉取血,分离出肝脏组织标本。检测大鼠血清中的谷丙转氨酶(Alanine Aminotransferase,ALT)、谷草转氨酶(Aspartate Aminotransferase,AST)活性。检测大鼠血清中甘油三酯(Triglycerides,TG)、总胆固醇(Total Cholesterol,TC)、酒精(Ethanol,EtOH)、氨(Ammonia)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽(Glutathione,GSH)的含量。检测肝脏组织中柠檬酸合酶(Citrate Synthase)以及乌头酸酶(Aconitase)的活性。采用苏木素-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色法检查肝脏病理改变,采用电镜观察肝组织中的脂滴现象,采用Western Blotting法检测肝组织SIRT1、β-catenin、Acetyl-β-catenin、CYP2E1、SOD-2 等蛋白水平。2、丹酚酸A在EtOH诱导的细胞损伤中的保护作用及相关机制的研究(1)Aml-12、L02细胞分成五组:正常对照组;EtOH损伤组(100mM);丹酚酸A(0.5μM、5μM、50μM)低、中、高剂量预处理+EtOH损伤组。丹酚酸A(0.5μM、5μM、50μM)低、中、高剂量预处理+EtOH损伤组需用丹酚酸A与细胞共同孵育6h后,用EtOH处理24h。细胞给药造模等操作完毕后用CCK-8法检测细胞活性。(2)Aml-12细胞分成三组:正常对照组;EtOH损伤组(100mM);丹酚酸A(50μM)EtOH损伤预处理组。采用尼罗红染色法检测细胞中脂滴数量。(3)Aml-12细胞分成四组:正常对照组;丹酚酸A(50μM)正常预处理组;EtOH(100mM)损伤组;丹酚酸A(50μM EtOH损伤预处理组。采用荧光素酶报告基因法检测β-catenin介导的转录活性。采用免疫荧光方法观察细胞中β-catenin的分布和ADH的改变。(4)Aml-12细胞分为四组:阴性对照组(si-control);阴性对照+丹酚酸A组(50μM);siRNA组;siRNA+丹酚酸A(50μM)组。转染后,丹酚酸A作用6h EtOH诱导24h后提取细胞蛋白。Western Blotting法检测细胞内SIRT1及β-catenin的蛋白表达情况,免疫沉淀法检测β-catenin蛋白的乙酰化水平。结果:酒精的摄入引起大鼠血清中ALT、AST、TG、TC、EtOH、氨、MDA等水平的上升及GSH水平的下降,同时使大鼠肝脏柠檬酸合酶、乌头酸酶活性明显降低。而丹酚酸A处理能明显改善这些情况。丹酚酸A能够减轻酒精造成的脂质积累、CYP2E1表达的升高和SOD-2表达的减少。机制上,丹酚酸A通过激活SIRT1调控β-catenin的乙酰化水平,影响β-catenin在细胞核中的分布以及β-catenin的活性。以上结果表明丹酚酸A可以通过激活SIRT1/β-catenin信号通路减轻酒精引起的慢性肝损伤。结论:SIRT1/β-catenin信号通路在酒精引起的慢性肝损伤疾病中起关键性作用;丹酚酸A通过激活SIRT1降低β-catenin的乙酰化水平,增加β-catenin在细胞核中的分布以及β-catenin的活性,抑制酒精代谢过程中引起的酒精代谢相关酶的损伤、氧化应激水平的升高以及线粒体功能的紊乱。以上结果表明丹酚酸A在酒精引起的慢性肝损伤中起保护作用与SIRT1/β-catenin信号通路的激活密切相关。