论文部分内容阅读
背景:肺癌是一种常见恶性肿瘤,具有较高发病率和死亡率,已严重威胁人类健康。在我国其患病率居高不下,尤其云南宣威地区肺癌的患病率占据全国首位。目前认为肺癌的发生和进程与癌基因的表达调控机制有关。GCNT3是一种重要黏蛋白合成酶,在肝细胞癌、大肠癌和胰腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭过程中扮演了重要角色,与其发生相关,而与非小细胞肺癌(NSCLC)发生是否相关,未见报道。为此,本实验室前期对宣威和曲靖地区NSCLC患者的癌组织、癌旁组织样本进行转录组芯片测序,发现GCNT3是NSCLC发生的一个促癌基因,其作用机制尚不明确。鉴于此,本论文对GCNT3参与NSCLC发生的作用机制展开研究,为NSCLC早期检测提供新靶点,为其治疗提供理论依据。方法:1.采集15例非小细胞肺癌患者癌组织和癌旁组织,转录组芯片测序筛选出NSCLC癌组织显著高表达的基因GCNT3;采用q RT-PCR和免疫组化技术检测配对NSCLC癌组织和癌旁组织中GCNT3 mRNA和蛋白表达水平差异,并分析GCNT3表达水平与NSCLC患者临床病理参数的关系;2.在NSCLC细胞系干扰和过表达GCNT3基因后,研究对NSCLC细胞系生物学行为(细胞周期、凋亡、增殖、迁移和侵袭)的影响;3.采用mi Rip技术将能与GCNT3基因3’UTR区域探针序列结合的mi RNA分子沉淀,并通过micro RNA芯片,筛选能调控GCNT3表达的上游分子mi R-302b-3p;在NSCLC细胞系导入外源mi R-302b-3p,检测对NSCLC细胞系生物学行为(细胞增殖、迁移、侵袭)的影响;此外,设计恢复实验,在外源表达mi R-302b-3p的同时过表达GCNT3,检测mi R-302b-3p导致的NSCLC细胞系生物学行为(细胞增殖、迁移、侵袭)改变能否通过GCNT3过表达得以恢复;并同时检测mi R-302b-3p表达以及同时过表达mi R-302b-3p和GCNT3对GCNT3蛋白、EMT通路和Erk通路蛋白表达的影响。结果:1.组织mRNA芯片测序(P=8.4×10-7,上调倍数=4.382)、q RT-PCR(P<0.001)、免疫组化(P<0.001)检测和TCGA数据库(P<0.001)分析结果均发现,GCNT3基因在NSCLC癌组织中表达显著升高;且上调的GCNT3蛋白表达与NSCLC患者TNM分期(P=0.0078)、淋巴结转移情况(P=0.0016)和术后生存期有关(P=0.0033),而与年龄、性别和肿瘤大小参数无明显相关(P>0.05)。2.q RT-PCR和Western blot检测GCNT3在NSCLC细胞系中的表达水平,发现在XWLC和NCI-H292细胞系GCNT3蛋白和mRNA表达水平显著升高(P<0.001);敲低GCNT3表达能显著抑制NSCLC细胞系(XWLC和NCI-H292)增殖(PNCI-H292<0.01,PXWLC<0.001)、迁移(PNCI-H292<0.001,PXWLC<0.01)和侵袭(PNCI-H292<0.01,PXWLC<0.01)能力,促进细胞凋亡(PNCI-H292<0.001,PXWLC<0.001),阻滞细胞周期(PNCI-H292<0.01;PXWLC<0.001);过表达GCNT3能显著促进NSCLC细胞系增殖(PNCI-H292<0.05,PXWLC<0.01)、迁移(PNCI-H292<0.05,PXWLC<0.01)和侵袭能力(PNCI-H292<0.05,PXWLC<0.05)。3.通过mi R-Rip技术结合micro RNA芯片检测,发现mi R-302b-3p与GCNT3基因结合作用最为紧密;q RT-PCR检测发现,在XWLC和NCI-H292细胞系mi R-302b-3p表达水平显著降低(P<0.001);过表达mi R-302b-3p能显著抑制NSCLC细胞增殖(PNCI-H292<0.001,PXWLC<0.05)、迁移(PNCI-H292<0.001,PXWLC<0.01)和侵袭(PNCI-H292<0.01,PXWLC<0.01)能力;检测与细胞迁移和侵袭有关的标记物发现N-cadherin和Vimentin表达显著降低,而E-cadherin表达显著升高;于两株NSCLC细胞系共转染mi R-302b-3p和GCNT3过表达载体后,发现过表达mi R-302b-3p对NSCLC细胞的增殖(PNCI-H292<0.05,PXWLC<0.05)、迁移(PNCI-H292<0.01,PXWLC<0.01)和侵袭(PNCI-H292<0.001,PXWLC<0.01)能力的抑制作用,能在同时过表达GCNT3基因的条件下得以恢复;检测与细胞迁移和侵袭有关的标记物发现N-cadherin、Vimentin和E-cadherin表达水平恢复;另外,对通路蛋白Erk的检测结果表明,mi R-302b-3p能显著下调p-Erk蛋白水平,而在转染了mi R-302b-3p的NSCLC细胞中共转染GCNT3过表达载体,检测到恢复了GCNT3基因表达的同时,p-Erk蛋白水平也得到恢复。结论:GCNT3在NSCLC组织和细胞系中表达显著上调,且上调的GCNT3表达与NSCLC患者肿瘤TNM分期、淋巴结转移情况和术后生存期有关;GCNT3作为一个NSCLC促癌基因,受上游mi R-302b-3p的调控,参与NSCLC细胞的增殖、迁移和侵袭等细胞生物学过程;mi R-302b-3p负向调控GCNT3参与NSCLC发生的过程可能依赖于Erk通路的抑制。