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目的:1.利用RT-PCR及Western Blotting技术,观察心衰时,Kv1.3等离子通道的mRNA及蛋白质的相对表达,体外给予EPL,观察其变化,为心衰的免疫学机制提供证据;2.建立体外SD大鼠乳鼠心肌成纤维细胞(CFs)和正常成年SD大鼠脾脏CD4+CD25+ Tregs(下文统称为Tregs或Treg细胞)共孵育体系,通过分子生物学手段检测Tregs是否促进CFs的增殖,给予依普利酮(eplerenone,EPL)作用后,观察其对两种细胞的增殖的影响。方法:1.免疫磁珠分选法分选心衰患者和正常健康志愿者的外周血中的Treg细胞,按如下方式分组培养:正常组,CHF组,CHF + EPL(30μM)组;CCK-8法检测各组Treg细胞的增殖情况,RT-PCR技术检测Treg细胞的Kv1.3、KCa3.1及CRAC通道mRNA的相对表达水平,In-cell western blotting法检测Treg细胞的Kv1.3通道及KCa3.1通道蛋白质的相对表达水平。2.运用免疫磁珠分选法分选正常成年SD大鼠脾脏Treg细胞,差速贴壁法分选SD大鼠3～10日龄乳鼠的CFs,按如下分组实验:CFs、CFs + Tregs、CFs + Tregs+ EPL(30μM)、Tregs。分别运用CCK-8法检测各组CFs的增殖情况,ELISA法检测培养液中的Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和基质金属蛋白酶(MMP2)的蛋白质的相对表达水平,RT-PCR技术检测Treg细胞中的Kv1.3通道、KCa3.1通道及CRAC通道mRNA的相对表达水平,In-cell western blotting法检测Treg细胞的Kv1.3通道蛋白质的相对表达水平,ELISA法检测不同培养条件下Treg细胞内外液中TGF-β及IL-10的浓度。结果:1.人外周血检测中,与Ctrl组相比,慢性心衰组Treg细胞的Kv1.3,KCa3.1及CRAC通道mRNA均出现高表达(P<0.05),在给予心衰组Treg细胞EPL(30 μM)孵育48 h后,其Kv1.3通道和KCa3.1通道mRNA及蛋白质的相对表达较慢性心衰组均有显著降低(P<0.05)。2.共孵育体系培养48 h后,CFs细胞增殖达到平稳期,共培养组CFs增殖被显著促进(P<0.05),EPL对其增殖有抑制作用(P<0.01);共孵育培养体系中Ⅰ型、Ⅲ型胶原和MMP2的蛋白质相对表达水平较均CFs单独培养体系明显增加(CFs + Tregs vs CFs,P<0.01);给予EPL后,分泌的Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原及MMP2被明显抑制(CFs + Tregs vs CFs + Tregs + EPL,P<0.01);共培养体系中 Treg 细胞的 Kv1.3、KCa3.1、CRAC通道mRNA的相对表达水平均明显增加(CFs + Tregs vs Tregs,P<0.01);给予EPL后,三个离子通道的mRNA的相对表达均被抑制(CFs + Tregs + EPL vs CFs +Tregs,P<0.01),其中Kv1.3通道的抑制最为显著;共孵育培养体系中Treg细胞的Kv1.3通道蛋白质的相对表达相较于单独培养Tregs显著增加(CFs + Tregsvs Tregs,P<0.01),EPL作用后,该通道的蛋白质相对表达被明显抑制(P<0.01);共孵育后,Treg细胞内外液中TGF-β与IL-10水平增加无统计学意义(2.7倍vs 2.2倍),但Treg细胞内TGF-β的增加量显著高于IL-10的增加量(5.8倍vs 1.8倍);30 μ依普利酮抑制细胞内TGF-β水平明显高于对IL-10的抑制,而抑制细胞外两种因子的水平无统计学差异。结论:慢性心衰发生时,Treg细胞Kv1.3等离子通道的mRNA及Kv1.3、KCa3.1通道的蛋白质均出现高表达,说明机体在心衰时,Tregs被活化。体外给予EPL可明显抑制Kv1.3等离子通道mRNA的表达。体外共孵育Tregs和CFs后发现对两种细胞的增殖均有促进作用,且CFs的增殖远比Tregs的增殖明显,通过EPL对Kv1.3通道抑制作用的检测,认为Tregs通过Kv1.3功能增强介导并自分泌TGF-β使自身功能活化,而TGF-β作为重要的致纤维化因子促进了成纤维细胞的增殖,这可能是心衰发生发展的免疫学机制之一。