非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma, NHL)是来源于B、T淋巴细胞的免疫系统恶性肿瘤,在NHL发生发展过程中,淋巴瘤细胞通过多种免疫机制以逃避机体的免疫监视系统。调节性T细胞(regulatory T cells, Tregs)在淋巴瘤的免疫逃逸和免疫耐受过程中发挥重要作用。许多研究致力于减少Tregs数量及/或功能,提高效应T细胞(effector T cells, Teff)的功能,从而阻断淋巴瘤免疫耐受形成的关键通路,期望对NHL免疫疗法起到关键性的辅助作用。Bopp T等的研究发现Tregs可以通过细胞间的缝隙连接将环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)转运至Teff细胞内,从而提高了Teff细胞内cAMP含量,抑制了白介素2的合成。提示免疫细胞内的cAMP含量与Tregs介导的免疫逃逸过程有着密切关系。近年来研究证实,小剂量环磷酰胺(cyclophosphamide, CY)在肿瘤及自身免疫病的治疗中发挥免疫调节作用。CY是细胞毒类烷化剂,广泛应用于淋巴瘤化疗中,但是尚无小剂量环磷酰胺在淋巴瘤动物模型中免疫调节机制的相关研究。本研究中我们将小剂量CY应用于NHL动物模型中,探讨了CY对Tregs细胞的作用机制。本研究为创新性研究。在淋巴系统恶性肿瘤发展的过程中涉及多种信号途径,细胞是存活还是凋亡取决于细胞内及细胞间多种信号途径之间的平衡网络。其中cAMP信号途径在淋巴瘤细胞凋亡过程中的作用日益受到重视,提高淋巴瘤细胞内的cAMP浓度有助于促进恶性淋巴细胞的凋亡,从而达到靶向治疗的目的。本研究通过应用分子生物学、细胞生物学、动物实验以及免疫学技术,阐明了cAMP信号途径在小剂量环磷酰胺逆转NHL动物模型中免疫逃逸过程的作用。同时对小剂量环磷酰胺和cAMP拟似物的协同作用进行了初步探讨。寻求淋巴瘤免疫治疗的新方法,提高临床治疗效果。第一部分：小剂量环磷酰胺逆转NHL动物模型免疫逃逸过程的作用研究目的：本研究中,为了研究小剂量环磷酰胺(20mg/kg)对Tregs的抑制作用,我们选用小鼠B细胞淋巴瘤细胞株A20细胞建立侵袭性淋巴瘤小鼠模型。首先比较了治疗前后各组小鼠的荷瘤生存期及肿瘤直径变化。并进一步制备引流淋巴结的单细胞悬液,通过磁珠分选,获得纯化的Tregs和Teff细胞。检测免疫细胞的Foxp3及IL-2表达等指标,观察小剂量CY治疗前后Tregs和效应T细胞的功能变化。材料与方法：1.细胞培养和动物实验2.单细胞制备3.蛋白提取及蛋白印记分析4.提取RNA,进行RT-PCR5. Tregs及效应T细胞(Teff)的分离6.流式细胞仪分析7.统计学分析结果：1.A20细胞培养及小鼠模型的建立(图1)(1)小鼠B系淋巴瘤细胞株A20由中山大学肿瘤研究所馈赠,应用含10%灭活的胎牛血清、青霉素(100U/m1)以及链霉素(100mg/mL)的RPMI-1640(Gibco)全培养基,在37℃,5%C02条件下培养。每2-3天传代一次。所有实验均选用对数生长期的细胞。(2)制备A20细胞悬液：在A20细胞株处于对数期生长的情况下,使用不含血清的1640培养基洗净细胞,离心,170g,10min,调整密度至5×10’/mL。(3)选取6-8周龄BALB/c近交系小鼠,在右背部皮下注射A20细胞悬液100μL。正常组以PBS溶液代替A20细胞悬液。肿瘤植入后7天,给予20mg/kg CY。2. BALB/c小鼠NHL模型的观察对接种A20细胞的小鼠的成瘤情况进行观察,成瘤率为90%。皮下注射A20细胞悬液后7天、14天、21天、28天分别测量两组荷瘤小鼠的肿瘤直径,CY治疗后肿瘤直径明显缩小,生存期延长,延缓了肿瘤发展(图2A和B)。3.流式细胞术检测3.1荷瘤小鼠引流淋巴结内CD+CD25+T细胞比值变化在荷瘤小鼠的引流淋巴结内,CD4+CD25+T细胞占淋巴细胞的比例肿瘤组明显高于正常对照组,CY治疗后下降,8天达到最低点,差异有统计学意义(p=0.0004)(图3)。3.2MACS提取CD4+CD25-T细胞,CD4+CD25+T细胞的纯度测定通过流式细胞术证实,使用MACS技术分离后得到的CD4+CD25-T细胞纯度在98%以上,CD4+CD25+T细胞纯度在90%以上。4.实时定量RT-PCR检测Foxp3表达Foxp3mRNA表达量在荷瘤小鼠引流淋巴结中表达高于对照组。CY治疗可以明显降低Foxp3表达,在治疗8天时达到抑制最低点,后Foxp3表达逐渐恢复至治疗前(图4)。5. WesternBlot技术检测各类T细胞内FoxP3蛋白的表达MACS技术分离得到的淋巴结内CD4+CD25+T细胞,可见到FoxP3蛋白表达。经小剂量CY治疗后Foxp3蛋白表达量随着时间有变化。第8天最低,第14天恢复(图5)。6.实时荧光定量PCR检测IL-2表达BALB/c小鼠IL-2mRNA表达量显著高于荷瘤组。随着CY作用时间不同,IL-2表达量显示出先升高后降低的趋势,CY治疗第8天达到最高水平,与荷瘤小鼠比较有显著差异(图6)。结论：1.A20B细胞淋巴瘤小鼠模型是一种良好的NHL动物模型。2. Tregs在淋巴瘤动物模型中高表达,与肿瘤免疫耐受相关。3.小剂量环磷酰胺可短暂下调动物模型中Tregs比例及功能,刺激效应T细胞功能,有望逆转免疫耐受。4.小剂量环磷酰胺延长动物模型的荷瘤生存期,是通过免疫调节发挥作用。第二部分：cAMP在小剂量CY抑制Tregs过程中的作用研究和cAMP拟似物对NHL细胞凋亡作用的研究目的：淋巴瘤小鼠模型中小剂量CY发挥了免疫调节作用,在本部分,我们进一步研究了免疫细胞内cAMP含量在CY作用过程中的变化,以明确CY的作用机制,为cAMP信号途径与环磷酰胺途径的协同作用奠定理论基础。肿瘤细胞是存活还是凋亡取决于细胞内及细胞间多种信号途径之间的平衡网络。其中cAMP信号途径在淋巴瘤细胞凋亡过程中的作用日益受到重视。本研究中,我们将临床常用的cAMP拟似物作用于A20淋巴瘤细胞株,并研究了CY和cAMP拟似物对动物模型的肿瘤组织中磷酸化及未磷酸化AKT的变化,探讨淋巴瘤细胞的凋亡机制,从而达到靶向治疗的目的。材料与方法：1.细胞培养及动物实验2.免疫细胞内cAMP含量测定3.肿瘤组织蛋白提取及蛋白印记分析4.流式细胞仪检测A20细胞凋亡及周期阻滞5.免疫组化研究6.统计学分析结果：1.不同免疫细胞内cAMP含量变化我们检测了小剂量CY治疗前后免疫细胞内的cAMP含量变化。明确cAMP信号途径在小剂量环磷酰胺作用过程中的重要作用。1.1CD4+CD25-T细胞内cAMP含量变化：BALB/c小鼠Teff细胞内较荷瘤小鼠低,CY治疗4天后细胞内cAMP含量逐渐降低,第8天降至最低,治疗14天时再次升高。CY治疗第8天与治疗14天比较,差异有统计学意义。1.2CD4+CD25+T细胞内cAMP含量变化：荷瘤小鼠较BALB/c小鼠Tregs细胞内含量高,CY治疗4天后细胞内cAMP含量逐渐降低至第8天最低,治疗14天时再次升高。CY8天与14天比较,差异有统计学意义(图8)。2.A20细胞株凋亡在不同浓度的cAMP拟似物诱导下,A20细胞出现不同程度的凋亡,周期阻滞不明显。3.肿瘤组织中AKT磷酸化及未磷酸化形式的蛋白含量改变小剂量CY对NHL动物模型中的肿瘤组织AKT形式磷酸化没有影响。而cAMP拟似物可以抑制磷酸化AKT的表达。4.免疫组化结果小剂量CY对NHL动物模型中的肿瘤组织AKT形式磷酸化没有影响。而cAMP拟似物可以抑制磷酸化AKT的表达。结论：1. cAMP拟似物诱导淋巴瘤细胞株凋亡2.小剂量CY对NHL动物模型中的肿瘤组织AKT形式磷酸化没有影响。3. cAMP拟似物可作为良好的候选药物。4. cAMP信号途径在小剂量环磷酰胺逆转免疫耐受中发挥重要作用。5.以似物和小剂量环磷酰胺的协同作用将在淋巴瘤治疗中有应用前景。