脊椎动物体内骨骼的骨化过程主要由膜内成骨与软骨内成骨两种形式组成,其中四肢的骨骼主要以软骨内成骨形式骨化。软骨内成骨表现为骨间充质细胞先形成软骨中间体,再矿化为硬骨。这一细胞分化的过程受到信号通路的精细调控,其中FGF信号通路发挥着重要作用。Fgf8是FGF信号通路的重要传导分子,我们实验室过去的实验表明,Fgf8可以促进颅面部间充质细胞向软骨分化。我们实验室前期构建了Shox2Cre/+小鼠,发现Shox2特异性的在肱骨间充质细胞中表达,并且参与了肱骨间充质细胞成骨分化进程。本研究将利用Shox2Cre/+小鼠、R26RFgf8小鼠（Fgf8条件性过表达小鼠）和R26Rm Tm G小鼠（Cre报告小鼠）,在四肢发育过程中,特异性在肱骨间充质细胞中过表达Fgf8,探究Fgf8的过表达对于肱骨间充质细胞成骨分化的作用。首先,我们通过小鼠交配,收取各个时期的Shox2Cre/+;R26RFgf8;R26Rm Tm G小鼠和同窝Shox2Cre/+;R26Rm Tm G小鼠胚胎,通过流式细胞仪分选出Fgf8过表达的间充质细胞,进行Real-time PCR检测。结果显示,同对照组相比,Shox2Cre/+;R26RFgf8;R26Rm Tm G小鼠的肱骨间充质细胞的Fgf8表达水平明显提升。说明Shox2Cre/+;R26RFgf8;R26Rm Tm G小鼠成功在肱骨间充质细胞中实现Fgf8的过表达。其次,收取各个时期的Shox2Cre/+;R26RFgf8;R26Rm Tm G小鼠与同窝正常野生型小鼠进行整骨染色、组织切片的HE和Azan染色,结果显示,Shox2Cre/+;R26RFgf8;R26Rm Tm G小鼠四肢肱骨组织中的硬骨组织缺失,而被软骨组织所替代,表明在四肢肱骨间充质细胞中过表达Fgf8会导致肱骨间充质细胞向硬骨细胞分化发生异常。最后,为了从基因表达水平确认Fgf8过表达改变了肱骨间充质细胞的成骨分化命运。我们通过免疫荧共定位实验,发现在Fgf8过表达小鼠中,Shox2 Cre/+谱系的肱骨间充质细胞不表达硬骨细胞的标志基因Sp7和Runx2,而大量表达软骨细胞的标志基因Sox9,证明了在四肢肱骨间充质细胞中过表达Fgf8会导致肱骨间充质细胞处于早期软骨细胞分化的状态,而不向硬骨细胞分化。进一步通过Western blot实验探究过表达Fgf8是激活了哪一条FGF下游信号通路,我们检测了FGF通路多个关键信号分子p-AKT、Akt、p-ERK,最终发现在肱骨间充质细胞中过表达Fgf8会上调p-ERK的表达,表明ERK信号通路被激活。综上所述,本实验通过遗传修饰小鼠的交配,获得了在四肢肱骨间充质细胞中过表达Fgf8基因小鼠的各个时期胚胎。进一步通过组织形态切片染色、实时荧光定量PCR和Western blot、免疫荧光共定位等技术手段,证明了在四肢的肱骨成骨发育过程中,在肱骨间充质细胞中过表达Fgf8会通过激活ERK信号通路,使得肱骨间充质细胞保持软骨化状态,改变其向硬骨细胞分化的命运,最后造成肱骨部位硬骨组织消失并软骨化。研究Fgf8过表达在四肢肱骨间充质细胞向硬骨细胞分化过程中起的作用,为四肢软骨发育异常机制提供理论基础,为骨关节炎的治疗提供实验数据,为解决常见性染色体显性遗传病提供实验数据,为临床靶向药物的研发和治疗方案的改进提供科学的理论依据。