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、阿茨海默氏病(Alzheimers disease,AD)是中枢神经系统的进行性退行性疾病。临床表现为进行性记忆和认知障碍,言语障碍,精神运动异常等,主要病理改变是老年斑(senile plaque,SP),神经纤维缠结(neurofibrillaiy tangle,NFT)及神经元空泡样变。随着免疫学和分子生物学的发展,研究者发现AD脑中存在着大量炎性因子如IL-1、IL-6、TNF-a、趋化因子、转化生长因子以及补体等,这些因子是由激活的小胶质细胞和星形胶质细胞产生的炎性因子,通过刺激这些细胞的活性,发生局部的免疫反应而增加β淀粉样肽的产生。因此深入了解炎性因子及其遗传多态性在AD慢性炎症病理改变中的作用,对进一步阐AD的分子及遗传发病机制并指导治疗有重要意义。肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNFα)具有双重、多样及网络性生物效应,不仅参与维持正常生理功能,还可在多种病理过程中异常表达并具重要作用。有研究证实TNFα基因启动子区域-308位点(转录起始位点上游第308bp)存在G/A多态性,这种基因多态性的存在可能影响TNF基因转录和表达,进而影响TNF的生物学功能。TNFβ也称淋巴毒素-α,是TNF超家族重要成员之一,与TNFα在基因和蛋白分子结构以及生物学功能上有许多相似之处,其基因位于染色体6p21.3,全长约为3kb,由4个外显子和3个内含子组成,广泛参与免疫系统的发育、炎症反应和免疫调节等。实验动物及人体研究表明TNF参与调控正常和异常的脑发育。
目的:
利用聚合酶链式反应(PCR)技术和酶免疫技术对AD和对照者的TNFα-308G/A、TNFβG+252A、apoE基因和血清TNF水平进行检测,旨在探讨TNFα-308G/A、TNFβG+252A、apoE等基因多态性及TNFα水平与Alzheimer病的关系。
方法:
1、研究对象：均为广东地区汉族人,饮食结构相似,各研究对象之间无血缘关系。AD组66例,男34例,女32例,平均年龄75.462±9.125岁,均为2004年7月-2005年10月广州老人院病人,全部病例应用简易精神状态检查量表(mini-mental state examination,MMSE)日常生活活动能力量表(activaies of daily living,ADL)初筛出存在痴呆,Hachinski缺血指数分<4分排除缺血性痴呆,哈密尔顿抑郁量表(HAMD)评分<8分排除抑郁状态。根据美国神经病学、语言障碍、卒中-老年性痴呆和相关疾病学会NINCDS-ADRDA的临床诊断标准诊断为临床很可能AD。对照组143例,男75例,女68例,平均年龄72.25±8.014岁。全部为生活在广州老人院的智能正常老年人,纳入标准：(1)无严重脑血管病及其他神经系统疾病(2)简易精神状态检查量表(MMSE)分值均高于与文化程度相对应的分界值。两组间性别和年龄无差异。
2、人外周血白细胞DNA的提取：静脉血2ml,EDTA抗凝,采用美国Gentra公司的DNA抽提试剂盒,抽提基因组DNA。
3、TNFα-308G/A基因多态性的检测：参照文献设计引物,PCR扩增TqNFα-308G/A基因后的产物长度为116bp,产物用NcoI限制性内切酶酶切,用3.5％琼脂糖凝胶电泳后,观察酶切后的产物长度。
4、TNFβG252A基因多态性的检测：参照文献设计引物,PCR扩增TNFβG252A基因后的产物长度为740bp,产物用NcoI限制性内切酶酶切,用1％的琼脂糖凝胶电泳后,观察酶切后的产物长度。
5、apoE基因多态性的检测：参照文献设计引物,PCR扩增apoE基因后的产物长度为292bp,产物用HhaI限制性内切酶酶切,用12％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后,观察酶切后的产物长度。
6、血浆TNF水平测定：取静脉血2ml,注入10％依地酸二纳(EDTA)30ul,在4℃下离心10 min,取血浆置-20℃保存至同批测定。酶免法测量血浆TNFα水平。
7、统计学分析：用SPSS11.5统计软件进行分析,计算上述基因的基因突变率、等位基因频率、基因型频率、基因多态性与疾病的相关性及相对危险度。计量资料组间比较用独立样本t检验,配对t检验和单因素方差分析,计数资料组问比较用X2检验。基因型及等位基因相对风险率以比数比(Odds Ratios,OR)及95％可信区间表示。
结果:
1.血浆中TNFα水平,AD组明显高于对照组,两组之间比较差异有显著性意义(P<0.05)。
2.AD组与正常对照组之间TNFα-308G→A突变无显著差异(p>0.05)。
3.AD与对照组TNFα-308G/A基因三种基因型携带者组间血浆TNF水平比较无显著性差异。
4.AD组与正常对照组之间TNF-β G252A突变无显著差异(p>0.05)。
5.AD与对照组TNF-β G252A基因三种基因型携带者组间血浆TNF水平比较无显著性差异。
6.TNFα-308G/A和TNFβ G252A的复合基因型在AD和对照组之间无显著性差异。
7.apoEε4等位基因可增加AD的患病风险[OR=6.521,95％CI(2.051-18.927),P=0.001],而ε3等位基因对于AD具有保护作用[OR=0.398,(0.197-0.794),P=0.008)]。apoEε4等位基因不影响TNFα-308G/A和TNFβ G252A三种基因的基因型或等位基因的分布频率。
结论:
在广东省汉族人群中,apoEε4等位基因是散发性AD的主要危险因素,ε3等位基因是AD的保护性因素；AD患者血清TNF水平显著升高,提示炎性反应在Alzheimer病程中有重要作用,TNFα-308G/A和TNFβG252A等位基因的出现不能被用来作为区分AD和健康对照人群的标识。