肺癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率呈现逐年上升的趋势，成为新世纪人类健康的严重威胁。近年来，肺癌的物理和化学治疗手段取得了很大进展，以顺铂为基础的单独或联合用药是肺癌最常用的化疗方案。许多新型抗肿瘤药也已应用于临床实践。然而，肺癌的5年生存率仍低于15％。探明肺癌发生、发展的分子机制，寻找有效的治疗手段，是亟待解决的难题和挑战。　　信号转导子和转录激活子(signal transducer and activator of transcription，STATs)是1992年研究干扰素诱导基因转录时首次鉴定的一个胞浆蛋白家族，是根据它们在信号转导中的作用来命名的，它们接收特异细胞表面受体的信号，诱发细胞内的转录改变。迄今为止，已经确认了7种不同的STAT分子，包括STAT1，2，3，4，5a，5b和6。STAT3是其重要成员，具有强烈的抑制细胞凋亡、促进细胞增殖的作用，参与了人类恶性肿瘤的发生和发展。已证实在许多人类肿瘤中存在STAT3活化。近年来，以STAT3为靶点的治疗措施取得了很大进展，通过直接或间接阻断STAT3信号通路抑制肿瘤细胞和异种移植瘤的STAT3活化，可以抑制瘤细胞增殖，促进凋亡。　　葫芦素(cucurbitacins)是从葫芦科及其它科属多种植物中提取的成分，具有多种生物活性，如细胞毒作用、抗炎和抗肿瘤作用等。近年来的许多研究表明，葫芦素B、D、E、I、Q等是JAK/STAT3信号通路的特异抑制剂，能降低多种癌细胞的STAT3活化水平，并降低STAT3的DNA结合能力和STAT3介导的基因转录，抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡，抑制异种移植瘤生长。葫芦素B被广泛应用于体内外抗肿瘤的研究中。　　本研究检测了葫芦素B单独或联合顺铂对肺癌细胞系A549细胞的体外抑制作用，并探讨其机理。　　材料和方法:　　一、葫芦素B对肺癌A549细胞增殖、凋亡的影响的研究　　用不同浓度的葫芦素B作用于A549细胞不同时间，倒置显微镜观察细胞形态改变，MTT法检测细胞增殖，流式细胞仪检测细胞周期分布和凋亡，荧光显微镜观察细胞凋亡，透射电镜观察细胞超微结构的变化。　　二、葫芦素B诱导肺癌A549细胞凋亡的机制的研究　　采用罗丹明123(Rho damine123)染色，通过流式细胞仪检测线粒体膜电位(△ψm);采用分光光度法检测caspase-3和caspase-9的活性的变化，采用Westenblot方法检测葫芦素B对细胞色素C、T-STAT3、p-STAT3、cyclin B1、Bcl-2的表达的影响。　　三、葫芦素B联合顺铂对肺癌A549细胞的作用　　不同浓度葫芦素B、顺铂单独作用或联合作用于A549细胞24、48和72 h，MTT法检测计算细胞增殖抑制率，证明两者联合是否有协同作用。0.1μmol/L的葫芦素B、5μg/ml的顺铂单用或联合作用于A549细胞24h，流式细胞仪PI单染检测细胞周期分布的变化，Hoechst33258核染色荧光显微镜观察细胞凋亡，流式细胞仪Annexin V/PI双标记法检测细胞凋亡率，Western Blot检测T-STAT3、p-STAT3、cyclin B1和Bcl-2的蛋白表达。　　结果:　　1、MTT实验结果显示葫芦素B对A549细胞的增殖抑制作用具有明显的剂量依赖性和时间依赖性。经ANOVA方差分析，P＜0.01。经LSD-t检验，不同剂量组之间、不同时间组之间及其与对照组之间的差异均有显著性意义(P＜0.05或P＜0.01)。　　2、PI单染流式细胞仪检测结果显示葫芦素B导致A549细胞G2/M期阻滞，同时伴有G0/G1期细胞减少，并具有剂量依赖性。经ANOVA方差分析，P＜0.01。经LSD-t检验，不同剂量组之间及其与对照组之间的差异均有显著性意义(P＜0.05或P＜0.01)。　　3、倒置显微镜和Hoechst33258染色荧光显微镜观察发现，随着葫芦素B作用浓度增加，细胞形态发生显著性改变，凋亡细胞明显增多，甚至出现大片细胞脱落形成细胞脱失区。　　4、AnnexinV/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡分析表明，葫芦素B作用A549细胞24h，随浓度的增高，早期凋亡和晚期凋亡细胞的比例都逐渐增加，与对照组相比差异具有显著性(P＜0.01)。　　5、通过透射电镜观察，对照组细胞的形态规整，细胞核较大，线粒体丰富，膜相结构完整;葫芦素B处理组细胞体积变小，胞质浓缩，胞浆内空泡增多，染色质固缩、边集或碎裂成不规则块状，线粒体肿胀。　　6、葫芦素B处理A549细胞24h后，caspase-3和caspase-9被活化，从而参与细胞凋亡的发生。细胞内的△ψm峰值下降，分布在去极化区域的细胞增多，与对照组比较有显著差异(P＜0.05或P＜0.01)，并可见细胞浆内细胞色素C逐渐增多，而线粒体内细胞色素C逐渐减少，细胞色素c由线粒体释放到胞浆中。　　7、Westemblot结果显示葫芦素B可以剂量依赖性抑制STAT3的活化，抑制细胞周期调控基因cyclin B1和抗凋亡基因Bcl-2的蛋白表达。　　8、体外实验显示葫芦素B联合顺铂对A549细胞的增殖抑制效应具有协同作用（24、48和72h三个时间点q＞1.15），引起细胞G2/M期阻滞和细胞凋亡率增加。Western Blot检测显示葫芦素B联合顺铂比单独应用更明显抑制p-STAT3、cyclin B1和Bcl-2的蛋白表达。　　结论:　　1、葫芦素B可以抑制体外培养的肺腺癌A549细胞的增殖。　　2、葫芦素B抑制肺腺癌A549细胞的作用是通过诱导细胞G2/M期阻滞和凋亡来实现的。　　3、线粒体途径参与葫芦素B诱导的肺腺癌A549细胞凋亡。　　4、葫芦素B抑制肺腺癌A549细胞的作用机理可能是通过抑制STAT3信号通路的活化，进而抑制细胞周期调控基因cyclin B1和抗凋亡基因Bcl-2的表达。　　5、葫芦素B和顺铂协同抑制体外培养的肺腺癌A549细胞的生长。　　6、葫芦素B和顺铂抑制肺腺癌A549细胞的作用是通过诱导细胞G2/M期阻滞和凋亡来实现的，联合应用比单药效果好。　　7、葫芦素B和顺铂联合应用，抑制STAT3信号通路的活化、抑制细胞周期调控基因cyclin B1和抗凋亡基因Bcl-2表达的作用明显比单药增强，但详细机理有待进一步研究。